一株杨树灰霉病原菌的分离及鉴定

冯连荣，宋立志，赵大根，矫丽曼

（辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115213）

新林1号杨（PopulusבXinlin 1’）是国有新民市机械林场培育的杨树品种，属于黑杨派与青杨派的杂交种[1]，树干通直，树冠冠形圆满，树枝多而密，雄株，无飞絮，2015年9月通过辽宁省林木良种委员会被审定为杨树良种，2016年10月取得了林木良种生产经营许可证。与意大利214杨（P.×euramericana cv.‘I-214’）、盖 杨（P.×gaixianensis）、107杨（P.×euramericana cv.‘Neva’）和108杨（P.×euramericana cv.‘Guariento’）相比，其生长优势明显且抗逆性较强[2]，目前在辽宁省内沈阳、锦州、葫芦岛等地被大面积推广，推广效果良好，是纤维材、胶合板材等原料林重要造林品种，也是重要的防护林造林品种之一[1]。

新林1号杨1年生扦插盆栽苗在温室内培养过程中，发现其中1株盆栽苗叶片上出现圆形病斑，为鉴定引起该病斑的病原菌种类，于室内进行了病原菌菌种分离，并利用rDNA-ITS序列分析进行了分子鉴定，为下一步研究该病原菌致病机理及防治方法等奠定基础。

1 试验材料与方法

1.1 植物材料

新林1号杨（PopulusבXinlin1’）1年生扦插盆栽苗，置于25℃人工智能温室内培养，空气湿度70%~80%。

1.2 酶和试剂

TaKaRa Ex Taq、DL2000 Marker购自TaKaRa生物工程有限公司、TIANGEN植物快捷型DNA提取系统（非离心柱型）试剂盒购自北京天根生化有限公司；引物ITS1：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4：TC CTCCGCTTATTGATATGC，引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.3 菌种分离

将采集的新林1号杨病叶于超净工作台中按下列步骤进行菌种分离：无菌水清洗病叶3遍，75%酒精消毒2 min，无菌水漂洗3次，0.1%HgCl消毒2 min，无菌水漂洗3次，剪取病健交界处叶片组织约0.5 cm2接种至PDA固体平板培养基中。每个平板接种2块，置于25℃生化培养箱中进行黑暗培养。待菌落直径为2 cm左右时，挑取菌落边缘菌丝进行转接、纯化，将纯化后的菌株命名为XL-1，于4℃冰箱保存备用。

1.4 致病性测定

根据柯赫氏法则，采用离体叶片接种，以菌丝块作为接种材料进行致病性测定。4℃冰箱中保存的菌株接种于PDA平板培养基上，25℃培养7 d，用直径为6 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼。取健康的新林1号杨中上部叶片，叶柄末端用浸水脱脂棉包裹，叶片表面用75%酒精擦拭消毒后，将菌饼放置在主脉两侧叶片上，每侧放置一个菌饼，对照处理接种PDA培养基块，将处理后的叶片放置在直径为11 cm的培养皿中，培养皿底部铺2层滤纸，滴1 mL无菌水进行保湿，25℃条件下培养，观察叶片发病情况。叶片发病后，从发病部位进行再次分离，通过柯赫氏法则以验证分离菌株是否为病原菌。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

4℃冰箱中保存的菌株接种于PDA平板培养基上，25℃培养7 d，无菌刀片刮取平板菌丝，经液氮速冻后进行研磨，用TIANGEN快捷型植物基因组DNA提取系统（非离心柱型）进行DNA提取，具体操作步骤按照说明书进行。提取后的DNA用TE Buffer溶解于－20℃保存备用，并利用DHS NanoPro测定DNA浓度。以DNA为模板进行ITS-PCR扩增，反应体系及应程序见冯连荣[3]。反应结束后，扩增产物送至TaKaRa（大连）生物工程有限公司进行测序，测序结果登录NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列BLAST比对分析。下载相似性序列，用Clustalw进行多序列比对，并辅以人工修正，分析时所有参数均为软件默认值。利用MEGA7.0软件采用N-J法构建进化树，进行系统发育分析，构建发育树时进行自举检验，重复抽样1 000次。

2 结果与分析

2.1 纯种菌丝的获得

经过组织分离及转接，获得了XL-1纯种菌丝，菌落特征见图1，菌落平展边缘整齐，菌丝絮状、灰白色，后期变为灰褐色，不产生色素。菌丝生长速度较快，5 d左右可以长满整个平板。

图1 XL-1菌落正、反特征Fig.1 Positive and negative characteristics of XL-1 colony

2.2 XL-1致病性测定

致病性测定结果（图2）显示,接种PDA培养基的对照组未产生病斑，接种XL-1菌饼的处理组发病，随着接种时间的延长病斑面积逐渐增大：接种后第2天，菌饼边缘长出菌丝，菌饼覆盖处叶片组织出现小病斑，病斑直径约1 cm；第3天病斑面积增大且菌丝透过叶片生长；第5天叶片表面出现大量霉层，第6天霉层布满整个叶片。对病斑组织再次进行病原菌分离获得相同菌丝，证明新林1号杨叶部病斑由XL-1引起。

图2 XL-1致病性测定Fig.2 Determination of pathogenicity of XL-1

2.3 XL-1分子生物学鉴定

提取XL-1菌丝DNA，利用DHS NanoPro测定DNA浓度为68.953 ng·μL-1，A260/A280为1.96。DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一明亮（图3A），证明DNA质量较好。以DNA为模板，ITS1/ITS4为引物进行PCR扩增，结果获得大小约为500 bp的目的条带（图3B）。PCR产物送至TaKaRa（大连）生物工程有限公司进行测序，测序结果显示目的片段

行BLAST序列比对，获得的相似序列均为Botrytis属真菌，大多数为B.cinerea和B.fabae，其中与登陆号为MH212236.1的B.cinerea覆盖度为100%，相似性为100%。下载排名靠前的B.cinerea和B.fabae序列，利用MEGA7.0构建进化树（图4），XL-1与B.cinerea聚为一支，亲缘关系较近。另外通过GenBnak下载Botrytis属标准菌株ITS序列，进行系统进化树构建（图5），结果显示XL-1同样与B.cinerea聚为一支，故将XL-1鉴定为B.cinerea（灰葡萄孢）。灰葡萄孢为丝孢纲（Hyphomycetes）丛梗孢目（Miniliales）丛梗孢科（Moniliaceae）葡萄孢属（Botrytis）。

3 结论与讨论

图3 DNA电泳结果Fig.3 Results of DNA electrophoresis

图4 基于ITS序列N-J法构建进化树Fig.4 Construction of phylogenetic tree based on ITS gene using N-J method

图5 基于N-J法构建XL-1与标准菌株的系统发育树Fig.5 Construction of phylogenetic tree of XL-1 and standard strains based on N-J method

杨树是辽宁省平原地区的主要造林树种，在防护林和用材林的建设中均占有重要地位，具有防风固沙、水土保持、农田防护、固碳释氧、净化空气等作用，同时还承担着产业建设的重任，为社会提供大量木材，解决木材短缺、供给不足的问题[1]。在杨树生长过程中，经常会受到各种病原菌的侵染，其中叶部病害较为常见，如杨树黑斑病[4]、杨叶锈病[5-6]、杨树叶枯病[7-8]等，目前关于杨树灰霉病的研究报道还比较少。杨树灰霉病主要危害杨树的茎和叶，在新植杨树中发生较重，影响杨树生长，降低了造林成活率，严重时可以导致杨树大面积死亡[9-10]。段冰冰研究表明Del/Ros基因在新疆杨（P.alba var.pyramidalis）的株系过表达，可显著提高新疆杨叶片中的丹宁、花青素、槲皮素、山奈酚以及总酚等黄酮类物质的含量，进一步提高了其对灰霉病的抗病能力[9]。吉海龙研究了长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）T05对灰霉病菌的抑菌活性，菌落对峙培养结果显示T05对灰霉病菌抑菌率达88.4%，其产生的挥发性物质对灰霉病菌抑菌率达91.9%[10]。

灰霉菌又称灰葡萄孢菌，是一种广寄主性的、能够引起多种植物幼苗、果实及储藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窖的病源菌[11]。潮湿时病部表层产生大量的灰色霉层（分生孢子梗和分生孢子），称为灰霉病。灰葡萄孢被认为是新鲜水果蔬菜中最重要的采后病原菌之一，也被认为是全球范围第二重要的植物病原菌[12-13]。它对各种重要经济作物的灾难性影响，造成全球每年100亿~1000亿美元不等的经济损失[14]。在葡萄（Vitis viniferax×V.labrusca'Shuijing'）[15]、番茄（Solanumlyco persicum）[16]、草莓（Fragaria×ananassa）[17]、人参（Panax ginseng）[18]、烟草（Nicotiana tabacum）[19]、蓝莓（Vaccinium spp.）[20]、浙贝母（Fritillaria thunbergii）[21]中均有报道。对于灰霉病菌的鉴定，一般基于形态特征并结合分子生物学鉴定来完成。形态特征一般从菌落形态、菌丝体、分生孢子及分生孢子梗等方面进行初步鉴定；分子生物技术鉴定应用最为广泛的是rDNA-ITS序列分析，如应用rDNA-ITS序列分析对蝴 蝶 兰（Phalaenopsis amabilis）[22]、香 葱（Allium ascalonicum）[23]、烟草[24]、番茄[25]等灰霉病的鉴定。在真核生物基因组的编码核糖体基因中有5SrDNA、5.8SrDNA、18SrDNA和28SrDNA这样4种，其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元，其中的间隔区为内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）,包括ITS1及ITS2两部分[26]。ITS序列通过与GenBank数据库进行BLAST检索比对,序列相似性为95%～99%，可以鉴别为相同属；序列相似性≥99%，可以鉴别为相同种[27]。随着分子生物技术的发展，越来越多的基因被应用于病原真菌的鉴定，如甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)、组蛋白（Histone）、翻译延伸因子1-α（Elongation factor，EF1-α）、微管蛋白(β-tubulin，BT1和BT2)、几丁质合成酶(chitin synthase，CHS)等[28-29]。

本研究从新林1号杨1年生扦插苗上分离获得一种引起叶部病害的病原菌XL-1，结合病原菌菌落形态特征和rDNA-ITS序列分析对病原菌种属地位进行了鉴定，其中与登陆号为MH212236.1的B.cinerea覆盖度为100%，相似性为100%，系统发育分析与B.cinerea聚为一支，虽然未进行多基因联合分析，从比对结果和系统发育分析可以确定分离病原菌为灰葡萄孢（B.cinerea）。该病原菌侵染杨树叶片后可迅速蔓延，导致整个叶片发霉腐烂，严重影响杨树的生长发育。下一步需要针对该病原菌的生物学特性、病原菌对不同杨树品种的致病能力和致病机理以及防治方法等进行深入研究，提出杨树灰霉病综合防治方法，以减轻其对杨树的危害。