肺泡巨噬细胞极化及凋亡在脓毒症急性肺损伤中作用机制的研究进展

高煜茹 王涛

脓毒症是一种由于细菌感染引发的全身炎症反应综合征，是入侵的病原体造成宿主机体反应失调从而导致多个器官功能障碍进而危及生命。急性肺损伤（ALI）是脓毒症中常见且致死率较高的并发症之一。ALI 的发病机制复杂，目前尚未完全阐明，但当前的研究表明炎症是ALI 的一个重要机制。肺泡巨噬细胞（AM）是肺内主要的先天免疫效应细胞，可根据环境信号改变自身的功能和表型。AM的高度可塑性在启动和化解肺部炎症中起着关键作用。当病原体入侵肺泡后，AM 会分泌高水平的促炎介质，巨噬细胞极化及凋亡失衡进而导致炎症级联调节失调是脓毒症急性肺损伤的主要病理生理机制，被认为是治疗脓毒症急性肺损伤的重要靶点。本文就AM 的概念、作用以及脓毒症急性肺损伤中的肺泡巨噬细胞极化及凋亡进行简要阐述。

1 肺泡巨噬细胞的概念

中性粒细胞和巨噬细胞的激活同为ALI 免疫及炎症反应的病理标志[1，2]，AM 是肺巨噬细胞（LMS）的一个亚群，来源于由卵黄囊中产生的晚期红系髓系祖细胞（EMPS）发育而来的胎肝单核细胞，在胚胎发育期间定植于肺，并在围产期形成完全成熟的AM。AM 是细支气管肺泡腔中含量丰富的细胞类型，约占肺泡白细胞的95%[3]，是肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT2s）产生的表面活性物质分解代谢的重要细胞。作为肺抵御外来刺激的重要效应细胞，在ALI 参与的肺部炎症的发病机制中起关键作用[4]。

2 肺泡巨噬细胞的表型和功能

AM 的活化促进ALI 中涉及的肺部炎症。巨噬细胞根据其特点及功能，大致被分为两个亚群，即经典激活的巨噬细胞M1 和交替激活的巨噬细胞M2。M1 巨噬细胞主要参与炎症及免疫反应，其在外部刺激的作用下，通过特异性受体及多个信号通路，可极化分泌包括白细胞介素及趋化因子在内的多种细胞炎性因子，其释放的一氧化氮（NO）倾向于抑制细胞增殖及诱导细胞损伤，且具有较高的抗原提呈活性及促炎表型，可消除细菌、真菌、病毒能引起感染的能力。M2 巨噬细胞包括三个亚群，分别为M2a、M2b、M2c，这三个亚群对不同的刺激产生反应，M2a 巨噬细胞由IL-4 和IL-13 诱导，M2b 巨噬细胞由免疫复合物联合LPS 或IL-1b 诱导，M2c巨噬细胞由抗炎刺激（包括糖皮质激素、IL-10 或TGF-b）诱导。但均表达较高水平的CD11 及抗炎因子（包括IL-10、CCL24、CCL22），抑制炎症反应及促炎免疫反应的进行，从而抑制组织及细胞的炎性反应，进而利于组织修复和血管形成[5]。有研究发现，暴露于LPS 后的巨噬细胞总数会明显增加，且以炎性M1 巨噬细胞增加为主，M1 表达产物也相应增加，与此同时抗炎M2 巨噬细胞会减少，其产物也相应减少[6]。

巨噬细胞在多种疾病及炎症反应中发挥重要作用，因此巨噬细胞的激活已成为免疫学、组织动态平衡、疾病发病机制以及消解和非消解炎症的关键领域[7]。巨噬细胞极化过程复杂，近几年的研究发现，巨噬细胞可表达一系列模式识别受体，包括Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）、炎症体和凝集素样受体，它们战略性地位于细胞膜、细胞质和内膜室[8]，进而介导巨噬细胞的极化，极化过程涉及多种分子机制，主要包括TLR4/NF-κB、JAK/STAT、TGF-β/Smads、PPARg、Notch 和miRNA 等信号传导途径及炎症影响因子[9]，通过调节各种炎症介质的合成和释放，AM 严重影响感染和非感染性刺激后ALI 的发展。

3 影响肺泡巨噬细胞极化的信号通路

3.1 TLR4-MAPK 信号通路LPS 可与Toll 样受体4（TLR4）相互作用，并与细胞内连接蛋白MyD88 接触。这种LPS-TLR4-MyD88 信号复合物进一步触发两种重要的信号级联，即NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径[10]，从而刺激巨噬细胞激活，进而MAPK 及其底物MK2 被p38 直接磷酸化和激活，MK2 激活后通过调节细胞因子如TNF-α、IL-6 来介导炎症反应。有研究证实，MK2 可调节由LPS 诱导的ALI 中炎症因子的产生进而影响巨噬细胞的活化，RNA 结合蛋白Lin28 可以实现在Akt1调控下调节TLR4 影响巨噬细胞的活化[11]。

3.2 TLR4-NF-κB 信号通路TLR4 是一种表达于巨噬细胞表面的天然免疫受体，能有效识别病原体相关的分子模式，是LPS 的主要受体。LPS 与TLR4结合，通过髓系分化因子88（MyD88）依赖的途径或干扰素调节因子（IRF）3 激活核因子-κB（NF-κB），从而促进炎症因子的表达[12]。最近，许多药物被证明通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路来抑制M1 巨噬细胞极化。例如，小檗碱可以竞争性地抑制TLR4和MyD88 的结合，抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路，从而抑制M1 巨噬细胞极化。同样，槲皮素下调NF-κB 和IRF5 的表达，进而抑制上游TLR4/MyD88 的活性，从而抑制M1 极化。此外，化合物NZ、甲异靛蓝等可抑制M1 巨噬细胞极化，这与下调TLR4/NF-κB 信号通路有关。阻断NRF2 可明显减弱DHA 对巨噬细胞中NF-κB/p65 转位的抑制作用，提示DHA 以NRF2 依赖的方式抑制巨噬细胞中的NF-κB 途径[12]。这些发现充分说明了TLR4/NF-κB 信号通路在M1 巨噬细胞极化中的重要作用。

3.3 TLR4-Akt/FoxO1 信号通路LPS 通过与TLR4受体结合，进一步诱导PI3K 蛋白的磷酸化，从而激活Akt 蛋白表达。FoxO1 是Akt 的一个关键下游蛋白，介导免疫调节，转化生长因子-β 增加了LPS刺激的巨噬细胞Akt 的磷酸化水平[13]。一旦Akt被激活，它就会诱导Akt 下游的靶蛋白p-FoxO1，p-FoxO1 被去磷酸化形成FoxO1 并转移到细胞核。FoxO1 可上调IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、CD44、活性Caspase-8、CD163、MDA5、IREα、BAX 和Caspase-3 的表达，下调IL-10、SOD-1 和Bcl-2 的表达，从而调节炎症、氧化应激和细胞凋亡[14]。

3.4 JAK/STAT 信号通路Janus 激酶（JAK）信号转导和转录激活因子（STAT）通路主要介导细胞因子受体的信号传导。IFN-γ 与其受体结合并激活JAK，诱导STAT1 的磷酸化，从而导致巨噬细胞对M1 的极化。此外，IFN-γ 可增强巨噬细胞对炎症介质的敏感性，并通过阻断对TLR 信号的反馈抑制而发挥协同作用，同时NF-κB 和MAPK 也可增强JAK/STAT1 的转录活性。此外，STAT3 在M2 巨噬细胞极化中也起了重要作用。研究表明，IL-6/STAT3 和JAK3/STAT3 信号通路的抑制导致巨噬细胞从M2 表型向M1 表型极化。细胞因子信号抑制因子（SOCS）是JAK/STAT 信号的反馈抑制因子。当SOCS1 和SOCS3 缺失时，可通过激活JAK1/STAT1 信号通路来促进M1 巨噬细胞极化。而STAT3 磷酸化的增加可以通过上调SOCS3 的表达而反馈抑制STAT1 的表达，从而抑制JAK/STAT1信号通路介导的巨噬细胞极化[12]。此外，STAT3 是Treg 细胞分化的决定因素，调节性T 细胞（Treg 细胞）是一种抑制性T 细胞亚群，通过多种机制发挥免疫抑制作用，并创造合适的免疫环境来控制免疫应答，Treg 细胞在ALI 的进展中起着至关重要的作用，Tregs 可通过调节免疫反应、促进肺泡上皮细胞增殖和组织修复来促进ALI 的恢复[15]，由M2 极化的细胞因子诱导的STAT6 调节簇及由干扰素激活的STAT1 信号可促进走向更抗炎和调节极化状态，但具体机制尚不明确[16]。

3.5 NLRP3/Caspase-1 信号通路NOD 样受体蛋白3（NLRP3）炎症体是由NLRP3、凋亡斑点蛋白（Asc）和前Caspase-1 组成的细胞内多蛋白复合体。Caspase-1 p10 是NLRP3 炎症体激活的生物标志物，当受到刺激时，NLRP3 炎症体的激活导致半胱氨酸天冬氨酸氨基转移酶-1（Caspase-1）的激活，随后通过复杂的途径将前白介素1β（IL-1β）和前IL-18 转化为成熟的生物活性形式，从而导致巨噬细胞对M1 的极化[17，18]，此外，有研究证明，NF-κB在NLRP3 炎症体的启动中发挥了重要作用[19]。

3.6 TGF-β/Smads 信号通路TGF-β 首先对Ⅱ型受体起作用，然后与Ⅰ型受体结合形成受体复合物，导致Ⅰ型受体结构域磷酸化，从而通过激活其下游信号分子（Smad2 和Smad3）调节相关基因的表达。有研究发现，来自TGF-β 超家族的生长分化因子3 通过促进Smad2 和Smad3 的磷酸化来抑制M1并促进M2 极化[14]。

3.7 MEK1/2-ERK1/2 通路MAPK 是一种应激激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其参与细胞因子产生、细胞迁移、细胞周期控制、DNA 损伤反应和转录调控。MEK1 和MEK2 参与细胞内信号网络，通过MEK1/2 依赖的丝氨酸和酪氨酸磷酸化对下游效应分子ERK1 和ERK2 进行控制[20]。MEK1/2-ERK1/2 通路可以被细胞外刺激，如生长因子和细胞因子，以及Ras 和Raf（13）下游的信号所激活，所以MEK1/2-ERK1/2 被认为可能是调节巨噬细胞反应的潜在机制之一[21]。通过对正常人和ARDS患者肺泡巨噬细胞的比较，发现ARDS 患者肺泡巨噬细胞MEK1/2-ERK1/2 通路的激活水平升高，提示巨噬细胞MEK1/2-ERK1/2 通路的异常信号可能与人ALI 的发病机制有关，可作为临床干预的治疗靶点。CSF1R 激活的下游分子MEK1/2、ERK1/2 和c-jun，可促使ERK1/2 及其下游转录因子c-jun 的磷酸化，CSF1-CSF1R-MEK1/2-ERK1/2-c-jun 轴可调节巨噬细胞向M1 或M2 极化状态[22]。

4 影响肺泡巨噬细胞极化的细胞因子

4.1 miRNAmiRNAs 是一类长度为22 个核苷酸的非编码RNAs，由各种类型的细胞通过外切体或蛋白质介导的途径分泌[10，11]。此外，生物学分析和功能研究表明，胞外miRNAs 具有高度的稳定性，不仅可以作为各种疾病的生物标志物，还可以作为新的信号分子参与巨噬细胞极化。芳香烃受体（AhR）是调节炎症和巨噬细胞极化的重要成分，其可以结合miR-142a 启动子转录激活miR-142a，通过AhR-miR-142a-IRF1/HIF-1α 轴降低M1 巨噬细胞极化、驱动M2 巨噬细胞抑制全身炎症和损伤[23]。miR-155 是脂多糖/干扰素-γ 处理的巨噬细胞中表达最高的miRNA，miR-155 通过外切体进入巨噬细胞促进炎症基因的表达（如IL-1β、IL-6和iNOS），也可通过CCAAT/增强子结合蛋白（C/eBP-β）信号级联促进巨噬细胞M1 极化。miR-146 具有强大的抗炎作用，它通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）-6、IL-1 受体相关激酶（IRAK1）、STAT-1 和TLR4 而促进M2 表型[24]。当miR-124 过表达，通过抑制PELI1/IRF5 轴并显著抑制IRF5 的核转位，抑制M1 巨噬细胞的极化[25]。此外，miR-122 被发现可激活巨噬细胞内TLR7 信号通路，导致巨噬细胞M1 极化，促进肿瘤坏死因子、白介素6、干扰素、白介素1 和一氧化氮合酶的表达，这也是肝功能不全所致急性肺炎症和组织损伤的主要原因[26]。

4.2 HSFHSF1 是一种参与热休克反应的转录因子，它调节热休克蛋白如Hsp27、Hsp60 和Hsp70的转录，这些蛋白在肺部炎症和损伤中发挥重要的细胞保护作用。有研究表明，HSF1 可以减轻LPS诱导的ALI 小鼠肺组织中巨噬细胞的浸润，因为巨噬细胞浸润受MCP-1 和CCR2 趋化因子的调节，HSF1 可通过降低MCP-1 及CCR2 的表达，从而抑制巨噬细胞浸润，在LPS 诱导的ALI 小鼠中发挥保护作用[27]。

4.3 MMP-9MMP-9（或称明胶酶B）属于MMPs家族，在炎症和肿瘤侵袭等病理过程中高度表达。MMP-9 是一种炎性细胞因子，其可在巨噬细胞中表达，在分泌炎性细胞因子中起着关键作用，可能与肺损伤的原因、潜在炎症的动力学、其他MMP 的伴随变化和/或MMP 的内源性抑制物[如金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs）]的活性有关。有研究表明，重组基质金属蛋白酶-9 本身不影响极化标志物，但在脂多糖存在的情况下，重组基质金属蛋白酶-9增加M1 标志物（IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS）的表达，降低脂多糖诱导的M2 标志物的变化（Arg-1、MRC-1、TGF-β、IL-10）[28]。

5 肺泡巨噬细胞的凋亡

肺部和全身炎症之间的相互影响增强了肺部的炎症过程，促进了ALI 的发展。新的证据显示肺泡巨噬细胞的凋亡可影响肺部炎症反应的进行[29，30]。炎症反应可促进中性粒细胞向肺内迁移，增加肺泡内细胞因子IL-6、肿瘤坏死因子α、β 的浓度，加重肺损伤的组织学表现，因此靶向影响AM 凋亡可能是控制肺部炎症的一种治疗策略[31]。外部因素可通过影响多个信号传导通路来调节炎症因子的分泌，进而促进肺泡巨噬细胞的凋亡，双向调节素（AREG）是肿瘤微环境关键调节因子，AREG 和TNF-α 由肺组织及肺泡巨噬细胞同时产生，可通过EGFR 途径直接抑制肿瘤坏死因子诱导的气道上皮细胞（AECs）的凋亡和Caspase 死亡信号的转导[32]。有研究表明，铁死亡也可影响细胞自噬及凋亡，衣康酸酯可以通过抑制巨噬细胞的铁死亡来减轻脓毒症引起的ALI[33]。细胞存活取决于Bcl2与Bax，有研究表明，白藜芦醇通过血管内皮生长因子-B 信号通路调节Bcl2/Bax 的表达，从而影响肺泡巨噬细胞的凋亡[34]。败血症诱导的ALI 的一种新的机制涉及中性粒细胞、巨噬细胞经历细胞死亡，释放核组蛋白导致组织损伤，从而加剧肺损伤。有研究证实，CitH3 多肽可刺激肺组织中Caspase-1的激活，并导致ALI[35]。

NLRP3 炎性小体可以激活一种巨噬细胞死亡的快速致炎形式，其特征是质膜破裂、胞浆内容物释放和DNA 片段化，其可整合病原体触发的巨噬细胞信号级联反应，激活Caspase-1，并将前-IL-1β 和前-IL-18 蛋白分解为其成熟的细胞因子形式IL-1β 和IL-18，导致巨噬细胞DNA 损伤和嗜酸性细胞死亡。有研究表明A 组β 溶血性链球菌M1 蛋白是Caspase-1 依赖的NLRP3 炎性小体激活的第二信号，并通过一种未知的机制触发钾外流，调节巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的死亡，加重组织损伤[36]，此外Caspase 11 在脂多糖诱导的巨噬细胞松弛中发挥重要作用，巨噬细胞松弛是一种由快速细胞裂解引起的程序性细胞死亡。

p-ERK 和p-JNK 是MAPK 的亚型，内毒素可使p-ERK 和p-JNK 激活增加，从而激活MAPK 信号通路，诱导相关途径的细胞死亡，JMJD3 是一种JmjC 家族的组蛋白去甲基酶，是由微生物刺激引起的TLR 活化诱导的，可被MEK/MAP 激酶激活，JMJD3 可通过依赖于NF-κB 以及STAT 依赖的途径来诱导，同时本身作为一个转录因子来诱导促炎细胞因子和趋化因子JMJD3 的表达增加，诱导促炎细胞因子的产生，影响线粒体膜的完整性，从而导致巨噬细胞凋亡，表观遗传修饰剂Aza 和TSA 可以抑制MAPK、JMJD3-STAT3 信号通路的活性，逆转内毒素诱导的巨噬细胞线粒体膜电位变化和凋亡信号基因的释放。以上研究是在骨髓来源的巨噬细胞上证实的，由此可推断上述机制在脓毒症引发的ALI 中也可能影响肺泡巨噬细胞凋亡[37]。

6 小结

ALI 是全身或肺部暴发性炎症的结果，病原体通过激活包括巨噬细胞在内的白细胞来引发炎症反应。肺泡巨噬细胞在宿主防御反应的前线发挥重要作用，肺泡巨噬细胞活化功能紊乱及下调被认为是ALI 的主要发病机制[38，39]，且这种凋亡是坏死性下调，如自分泌肿瘤坏死因子介导坏死性下调途径，不利于炎症清除[40]。巨噬细胞极化可以决定疾病的严重程度，可通过增强M2 巨噬细胞的极化以及减少肺泡巨噬细胞的坏死性下调抑制脓毒症所致的ALI。糖酵解代谢虽被认为是巨噬细胞促炎免疫反应的重要驱动因素，然而考虑到巨噬细胞群体的多样性和组织特异性，巨噬细胞可表现出明显的异质性，研究表明，组织驻留的肺泡巨噬细胞不依赖糖酵解来治疗内毒素诱导的炎症，进一步印证了肺泡巨噬细胞极化及凋亡在对抗炎症反应中的重要作用[41]，大量临床病例及实验数据表明，针对炎症性疾病，需要对巨噬细胞的激活、极化进行精细控制，有些实验方法可能无法清楚区分巨噬细胞与其他髓系细胞，这表明关键巨噬细胞亚群的功能差异被忽视。作为呼吸道中的主要巨噬细胞亚群，肺泡巨噬细胞通过清除碎片、表面活性物质和凋亡细胞，对维持肺的健康和功能至关重要[42]。因此，如果能够实现精准调控巨噬细胞极化及凋亡，对脓毒症所引起的ALI 的临床治疗将会有重要意义。