N6-甲基腺苷甲基转移酶样蛋白3在乳腺癌发生发展中的作用

吴华涛，崔玉坤

（1.汕头大学医学院第一附属医院普外科，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院附属肿瘤医院广东省乳腺癌诊治研究重点实验室，广东 汕头 515041）

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）最早于20世纪70 年代由Desrosiers 等[1]团队报道，是真核信使RNA（messenger RNA，mRNA）中最丰富的内部修饰方式。近年来，针对m6A修饰的研究越来越广泛，m6A主要出现在序列RRm6ACH（[G/A/U][G＞A]m6AC[U＞A＞C]）中，该甲基化修饰过程是可逆性的，包括甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等共同参与[2]。越来越多的证据表明，m6A不仅在正常的生理过程中发挥重要作用，在多种恶性肿瘤的发生发展过程中都占据重要地位[3]。

目前研究表明m6A修饰过程在乳腺癌发生发展中发挥着重要的作用，有望成为肿瘤治疗的新靶点[4]。其中甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like protein 3，METTL3）作为主要的m6A甲基化酶，通过调控下游分子甲基化水平参与正常生理和多种疾病的病理过程，且多项研究显示METTL3在人类多种恶性肿瘤中表达失调且具有致癌/促癌特性[3]。本文将总结METTL3 在乳腺癌发生发展中作用的最新研究进展，探索其对乳腺癌的调控机制及其作为乳腺癌患者治疗靶点的潜能。

1 参与m6A修饰的分子及其作用

研究已经证实，m6A对RNA的甲基化修饰是可逆化过程，调控因子包括甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等[5]。结构生物学研究表明，甲基转移酶METTL3 和METTL14 均具有关键的催化结构域，在m6A 修饰过程中，两者之间形成复合物，共同行使催化功能，其中METTL3 具有催化活性，而METTL14 主要负责底物识别，因此METTL3表达水平及活性对真核生物细胞内m6A修饰水平起到重要的作用。Huang等[6]指出，m6A相关修饰酶在肿瘤中的表达水平不尽相同，环境因素和基因位点突变均可导致m6A状态的改变，同时m6A修饰还可参与肿瘤靶向治疗基因的调控。因此，METTL3 在恶性肿瘤的发生发展中占有重要的地位。

2 METTL3分子在乳腺癌中的表达情况

Zhang 等[7]首先在乳腺癌干细胞（breast cancer stem cell，BSCS）中发现，在缺氧刺激下缺氧诱导因子可促进m6A 去甲基化酶ALKBH5 的表达，进而使多能性因子NANOG 的甲基化水平下调、表达增加并诱导BSCS 表型，而ALKBH5 表达的下调可显著减少BSCS 的数量，降低乳腺癌发生的能力，提示m6A甲基化水平对乳腺癌发生发展的重要作用，而m6A甲基转移酶METTL3的表达水平则可直接影响乳腺癌中m6A 的修饰水平。有趣的是，沉默METTL3 表达可抑制乳腺癌细胞的增殖能力，并增强其凋亡水平[8]。随后，Fry 等[9]在永生化的人类乳腺上皮细胞HMEC 中发现METTL3 表达及m6A 水平均下调，过表达METTL3可促进该细胞的增殖和迁移潜能。Wu等[10]利用生存分析及Cox 单因素分析发现METTL3 表达水平与乳腺癌患者不良预后密切相关；且另一项研究发现在乳腺癌组织及细胞中，METTL3的表达均显著升高[11]。

然而，一项针对转移率和恶性程度高的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC） 的研究则发现 ，METTL3在TNBC中呈低表达状态，且与TNBC患者短距离无转移生存率密切相关，敲除METTL3 可通过降低TNBC细胞中的m6A 水平进而增强细胞的迁移、侵袭和黏附能力[12]。Fry 等[9]则发现在永生化和转化的乳腺上皮细胞中，METTL3的表达及m6A甲基化水平均显著低于其亲本细胞。

3 METTL3调控乳腺癌的分子机制

3.1 METTL3促进乳腺癌增殖、抑制凋亡

失控性增长是恶性肿瘤重要的生物学特点之一，乳腺癌也不例外。研究认为在脊椎动物细胞凋亡过程中，线粒体处于凋亡调控的中心位置，而在线粒体通路中，凋亡信号激活含BH3 结构域的Bcl-2 家族成员，后者发生寡聚化并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，诱导细胞凋亡[13]。Wang 等[11]发现抗凋亡蛋白 Bcl-2 是 METTL3 的下游靶分子。在乳腺癌细胞和组织中，METTL3 表达水平显著增高，敲减METTL3 表达可下调Bcl-2 的m6A 及表达水平，进而促进肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖能力。Cheng等[14]在探索二甲双胍对乳腺癌的治疗作用的研究中，通过转录组测序发现p21是METTL3的潜在下游分子，METTL3可以通过依赖m6A的方式抑制p21的表达，从而促进乳腺癌细胞增殖；而二甲双胍则以p21为主要靶点，通过抑制METTL3 的表达降低乳腺癌细胞中m6A 水平，进而上调p21 表达，抑制乳腺癌细胞的增殖，提示METTL3 是二甲双胍治疗乳腺癌的潜在靶点。

METTL3 通过m6A 修饰不仅可以调控下游蛋白表达，还可以通过调控非编码RNA的表达水平调控后者的下游蛋白，进而影响乳腺癌发生发展过程。乙型肝炎X互作蛋白（hepatitis B X-interacting protein，HBXIP）的异常表达是驱动乳腺癌侵袭性进展的重要因素，Cai 等[8]研究发现HBXIP 可通过抑制小分子miRNA let-7g 进而上调METTL3的表达，而上调的METTL3则可通过上调HBXIP的m6A修饰水平，进而促进HBXIP的表达，两者正反馈调控，最终促进了乳腺癌的增殖并抑制了凋亡的发生。Rong等[15]发现长 链 非 编 码 RNA （long non-coding RNA， lncRNA）LINC00958 是METTL3 的下游分子，m6A 甲基转移酶METTL3 通过促进LINC00958 甲基化水平上调后者的表达，而LINC00958则在乳腺癌增殖进展过程中扮演促癌基因的作用，其通过吸附作用降低miR-378a-3p的表达，从而上调其下游基因YY1的mRNA 和蛋白水平，促进乳腺癌的增殖能力。而LINC00675 在METTL3 甲基化的修饰下则增强了其作为内源性竞争RNA 的作用，增强了其与miR-513b-5p 的相互作用，进一步抑制了miR-513b-5p 对下游基因的抑制作用，从而抑制了乳腺癌细胞的增殖能力和侵袭转移能力[16]。

近期，Wan 等[17]研究发现，在乳腺癌细胞中，PD-L1是METTL3 介导的m6A 修饰的下游靶点，抑制METTL3 表达可显著下调m6A修饰水平，降低PD-L1的稳定性，进而增强PD-L1介导的T细胞激活和浸润，在体增强抗肿瘤免疫，对肿瘤免疫治疗提供了新的治疗策略和思路。

3.2 METTL3促进乳腺癌转移

作为体表肿瘤，乳腺癌患者因癌死亡的主要原因是肿瘤的复发和远处转移，探索乳腺癌复发和转移的分子机制，将为延长患者生存期和提高患者生存质量提供帮助。Chen 等[18]筛选建立了乳腺癌肺转移细胞模型，即BCLMF3细胞，并进一步研究发现在BCLMF3细胞中m6A 甲基化水平及METTL3 的表达均显著升高，而去甲基化酶FTO 明显下调；METTL3通过甲基化角蛋白7（keratin 7，KRT7）的反义lncRNA KRT7-AS 的A877 位点，促进KRT7-AS/KRT7 mRNA 的稳定性及KRT7 的翻译和表达；体内实验和临床研究都同样证实METTL3 及其上调的KRT7 和KRT7-AS 均在乳腺癌肺转移过程中发挥重要作用，是治疗乳腺癌转移的重要靶点。LncRNA 转移相关肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1）也是METTL3甲基化的下游分子[19]。METTL3通过上调MALAT1 的m6A 修饰水平进而增加MALAT1 的表达，而MALAT1则可通过吸附miR-26b进而上调其下游分子高迁移率基团AT-Hook 蛋白2 （high mobility group at-hook protein 2，HGMA2），从而促进乳腺癌上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程和侵袭转移能力[19]。

另一方面，Li 等[20]则发现METTL3基因在乳腺癌中高表达环状circMETTL3，其作为内源性竞争性RNA 拮抗miR-31-5p的作用，进而上调其下游靶分子周期蛋白依赖性激酶1 促进乳腺癌侵袭转移，而其宿主基因METTL3则可通过m6A 依赖的方式上调circMETTL3 的表达，促进乳腺癌进展；该研究未发现circMETTL3 对其宿主基因表达的影响。然而，近期一项针对TNBC 的研究则认为circMETTL3 可作为miR-34c-3p 的吸附海绵进而促进其下游分子METTL3的表达，发挥抑制细胞增殖、侵袭和肿瘤生长转移的作用[21]。而免疫共沉淀研究发现，METTL3 可与EZH2 的mRNA 结合，并通过m6A 修饰促进后者的表达，进而通过下调E-cadherin 的表达促进乳腺癌细胞的EMT和转移过程，加重乳腺癌的进展[22]。

3.3 METTL3促进乳腺癌耐药

雌激素受体阳性的Luminal 型乳腺癌患者对含他莫昔芬等药物的内分泌治疗敏感，预后优于其他类型的乳腺癌患者。然而，他莫昔芬耐药的出现严重影响了患者生存期和生存质量，Liu等[23]发现在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞株中腺苷酸激酶4（adenylate kinase 4，AK4）和METTL4 表达均显著上调。研究表明，在他莫昔芬耐药的MCF-7乳腺癌细胞株中AK4的5′非翻译区存在多个m6A修饰位点，在METTL3 调控下，AK4 表达显著上调并进一步激活活性氧自由基的产生及p38的磷酸化水平，从而诱导乳腺癌细胞产生对他莫昔芬的抗性。

而METTL3 的高表达同样可以降低乳腺癌对阿霉素（adriamycin，ADR）的敏感性，研究表明，在ADR耐药的MCF-7 乳腺癌细胞中下调METTL3 表达可降低pri-miR-221-3p 的m6A 甲基化水平，从而抑制后者的成熟，降低miR-221-3p 及多药耐药蛋白1 和乳腺癌耐药蛋白的表达；另一方面，miR-221-3p 可通过与3′非翻译区结合负向调控同源结构域相互作用蛋白激酶2 （homeodomaininteracting protein kinase 2，HIPK2），进而诱导 ADR 耐药的MCF-7 乳腺癌细胞的抗性。METTL3/miR-221-3p/HIPK2信号轴的发现阐述了乳腺癌化疗耐药的表观遗传学分子机制，并提供了新的治疗靶点[24]。而Li 等[25]也发现MALAT1 作为METTL3 的下游分子同样参与了乳腺癌对ADR 耐药的过程，METTL3 甲基化修饰MALAT1 并上调后者的表达，进而招募转录因子E2F1 直接结合于人前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）的启动子区域促进AGR2 的表达，诱导乳腺癌细胞对ADR 治疗的抵抗。METTL3 同样参与了同源重组修复的调控，抑制METTL3表达可降低同源重组修复的效率，并通过调节EGF/RAD51轴的m6A 修饰水平增加ADR 所诱导的DNA 损伤[26]。上述结果均提示，METTL3 介导的化疗药物反应性改变，是恶性肿瘤治疗的重要分子机制。

3.4 METTL3促进乳腺癌肿瘤干细胞特性

肿瘤干细胞理论的提出为重新认识肿瘤的起源和本质提供了新的方向，也为临床恶性肿瘤的治疗提供了新的视角[27]，而对肿瘤干细胞标志物的筛选为该类研究提供了有力的平台[28]。Xie 等[29]研究表明，METTL3 在乳腺癌组织中高表达，同时与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关，而敲减METTL3 的表达可显著下调肿瘤干细胞标志物SOX2、CD133 和CD44 的表达水平，进一步抑制乳腺癌的侵袭转移能力，而RNA 免疫共沉淀实验证实SOX2 是METTL3 的靶分子，METTL3 可与SOX2 的mRNA 直接结合并富集SOX2的表达。

NANOG 是维持干细胞自我更新增殖和亚全能性的关键因子，属于胚胎干细胞的转录因子，可增强肿瘤干细胞的多能干性，增加了恶性肿瘤的复发风险[30]。而METTL3作为转录因子锌指蛋白217 （zinc finger protein 217，ZNF217）的下游分子可以抑制NANOG的表达，ZNF217通过下调METTL3 及m6A 水平促进NANOG 的表达，促进乳腺癌细胞的干性和进展[31]。

4 总结与展望

近期，He 等[32]利用TCGA 数据库，在775 例乳腺癌患者中分析了24 种与m6A 修饰相关的重要调节因子的表达情况，发现m6A调节因子与乳腺癌恶性程度、预后及抗肿瘤免疫反应等密切相关，提示m6A修饰在乳腺癌发生发展过程中起到重要的作用。而不同类型的恶性肿瘤中m6A甲基转移酶METTL3 的高表达均与患者不良预后密切相关，是肿瘤进展过程中的重要标志物[33]。本文通过对已发表的关于甲基转移酶METTL3 在乳腺癌中的作用分析后发现，METTL3主要通过提高乳腺癌细胞内m6A修饰水平调控下游蛋白或非编码RNA的表达水平，进而影响乳腺癌的发生发展过程。然而，由于表观遗传学中RNA 翻译的复杂性，现有的研究结果对METTL3在乳腺癌进展中的作用仍存在一定的争议，对METTL3的作用及其调节乳腺癌的关键步骤和分子机制仍需进一步研究和阐明。

虽然针对METTL3 作用的研究存在一定矛盾的结果，但其在乳腺癌中发挥促癌作用得到一定的认可，且以METTL3或m6A修饰为分子诊疗靶点的研究展现出了相应的效果，为患者带来希望，受到了广泛的关注[34]。此外，除了上述已报道的在乳腺癌中的作用机制外，METTL3 也在其他重要的生物过程起到重要的作用，如新陈代谢调节、血管生成失调、免疫逃逸等[35]。因此，深入研究并阐明METTL3及其调控的m6A修饰对明确乳腺癌发生发展的机制，完善相关分子调控网络，探索乳腺癌精准治疗的潜在靶点等均具有重要的意义。同时迫切需要研发针对METTL3的抑制剂或小分子药物，将为研究m6A修饰表型与乳腺癌表型间的关系提供条件，也使其在未来成功地应用于乳腺癌患者的治疗提供了可能。