纳米材料参与巨噬细胞自噬及抗动脉粥样硬化的研究进展

宋宇健，陈 芸

（1.佛山市第一人民医院超声诊疗中心，广东 佛山 528000；2.北京大学深圳医院超声影像科，广东 深圳 518036；3.汕头大学医学院，广东 汕头 515041）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是危害人体健康的心血管系统疾病之一，巨噬细胞与AS 关系密切。自噬是细胞的自我保护机制，调控巨噬细胞自噬可调节斑块内脂质流出、减少炎症小体的产生及氧化应激对血管的损伤，从而延缓AS的发展。在AS的治疗上，纳米材料与传统药物相比更具有精准化、靶向化的优势。本文阐述自噬相关机制及巨噬细胞自噬对干预AS的意义。

1 自噬及其调控机制

自噬是存在于大多数真核细胞的一种保护机制。自噬启动时，胞内形成双层脂质吞噬泡来吞噬降解的物质、错误折叠的蛋白及受损的细胞器等，吞噬后形成的自噬体随后与溶酶体相结合，转变为单层膜的自噬-溶酶体结构，溶酶体内的各种水解酶把底物分解为小分子物质予细胞重新利用，废物则与细胞膜融合后排出细胞[1]。

自噬的启动主要依赖于自噬相关基因（autophagyassociated gene，Atg）及由Atg基因编码的相关蛋白。微管相关蛋白轻链3（microtubule- associated protein light chain 3，LC3） 由Atg8编码，随后被活化的 Atg4 切割形成LC3-I。LC3-I 在 Atg12-Atg5-Atg16L 复合体的作用下聚集形成LC3-II，促进自噬小体的产生。目前常用LC3-II/LC3-I 的比例来评估自噬水平的高低。调控自噬的信号通路主要可分为2类：（1）经典I型：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3 kinase/Protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR） 抑制性通路[2]；（2） 经典III 型：PI3K/Beclin-1 激活性通路。在营养条件充足等有利于细胞生长的情况下，I 型信号通路激活，活化的蛋白激酶解除下游结节硬化复合物对mTOR 复合体，尤其是mTOR 复合物1 的抑制作用，增加mTOR 复合体的活性。mTOR 复合物1 随后磷酸化下游的真核启动因子4E 结合蛋白1 和S6 蛋白激酶1[3]，促进生长因子的表达，抑制自噬的发生，同时诱导细胞周期进入G1-S期，促进细胞生长增殖[4]。而在营养不足、应激等不利于细胞生长的情况下，III 型信号通路激活，Atg8-LC3 复合体及Atg12-Atg5-Atg16L 复合体增多，诱导自噬的发生。除此之外，胞质Ca2+的含量变化也会影响mTOR信号通路从而间接影响胞内自噬水平的变化。

2 巨噬细胞自噬与动脉粥样硬化

2.1 巨噬细胞自噬与脂质调控

AS 的发展与斑块内部的脂质水平有关，于微观上体现在巨噬细胞内脂质的含量。诱导巨噬细胞自噬有利于促进斑块内胆固醇流出。依目前观点来看，存在于巨噬细胞内部的脂滴可相当于一种细胞器。固醇和磷脂等单层极化脂质构成脂滴的外膜，而疏水的胆固醇酯、固醇酯及三酰甘油酯等则构成脂滴的核心。当自噬发生时，巨噬细胞内的脂滴被运送至溶酶体，与其内的酸性脂肪酶相接触，进而分解产生单分子脂质，最后通过相关的胆固醇流出载体蛋白（ATP结合转运盒1等）运送至胞外[5]，过程中高密度脂蛋白及载脂蛋白A-I 可分别参与对不同载体蛋白的调控。该过程称之为脂自噬。

巨噬细胞自噬与脂质流出关系密切。Zhang等[6]使用木犀草素对经过氧化低密度脂蛋白处理后的巨噬细胞的治疗作用进行研究，提示在经木犀草素处理后，细胞内自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I 的比例上升，伴随着脂质流出基因ABCA-1表达的蛋白含量升高，胆固醇和胆固醇酯含量下降。同样，Wang等[7]在经过白杨素处理的泡沫细胞脂质流出的实验中，也表明胆固醇可通过ABCA-1介导的途径流出，体现在ABCA-1基因表达的蛋白含量升高。脂自噬在调控AS上起着重要的作用。

2.2 巨噬细胞自噬与炎症反应和氧化应激

巨噬细胞参与血管壁的炎症反应，适当激活巨噬细胞自噬可以减少炎症小体的产生及炎症因子的释放从而对血管壁起保护作用，延缓AS 的进展。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体是沟通AS与炎症的桥梁。受激活的Toll样受体活化核因子-κB等转录因子，从而激活NLRP3、前体白介素1β及前体白介素18 基因的转录。活化的NLRP3 激活半胱氨酸蛋白酶-1，促使其切割前体白介素1β及前体白介素18，形成白介素1β及白介素18分泌至胞外。白介素1β和白介素18在AS 中起诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖、刺激血管内皮细胞增殖及促进泡沫细胞形成等作用[8]。两者协同可增加斑块的不稳，导致易损斑块的形成与破裂[9]。使用药物提高巨噬细胞自噬水平，可以抑制NLRP3 炎症小体的产生，在AS 中起保护作用。阿格拉宾从亮绿蒿中提取而得，其可通过激活自噬途径，抑制NLRP3 炎症小体产生，降低白介素1β及白介素18 的水平，从而达到抑制斑块形成和降低胆固醇水平的目的[10]。

氧化应激中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平与自噬相辅相成。聚集的ROS可激活细胞自噬从而反向清除ROS。声动力疗法可有效增加细胞内的ROS，研究表明该疗法可通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路和调控ROS依赖性的转录因子EB 核转位等途径来激活巨噬细胞自噬[11]。国内相关研究表明，声动力疗法对AS的影响可分为三个方面：诱导斑块内巨噬细胞凋亡、改善斑块炎症环境及促进斑块内脂质的流出。在AS 发展严重时，细胞基础自噬被打破，由功能失调的线粒体产生的ROS 降解受抑。以ROS为主的氧化应激反应直接损伤DNA、蛋白质等的构象，继发诱导自噬产生，大体上减少胶原合成致局部纤维帽变薄、易损斑块破裂、脱落及血栓形成。反之激活自噬，可清除线粒体源性ROS的产生且抑制NLRP3激活或通过泛素化来捕获和降解NLRP3炎症小体[12]。研究表明，巨噬细胞Atg5基因缺陷的低密度脂蛋白受体敲除的小鼠在AS晚期表现出氧化应激反应增强，加速了斑块发展[13]。提示巨噬细胞自噬与细胞氧化应激水平关系密切，为未来研究AS治疗提供了新的思路。

3 纳米材料对自噬的干预在动脉粥样硬化中的作用

纳米材料因其在光、电、磁和热等方面具有卓越的物理特性而广泛运用于检验诊断、负载药物及基因靶向治疗等生物医药领域。目前应用于AS 的纳米材料可分为以下几类：（1）可生物降解的天然高分子化合物，如多糖类（透明质酸、壳聚糖等）、蛋白类（白蛋白、酪蛋白等）。此类材料有良好的生物安全性与较低的毒副作用，通过分子修饰后可大幅提高其在人体内对病灶的靶向能力。研究报道通过使用CD44 受体与透明质酸相结合，可靶向识别巨噬细胞，间接显示巨噬细胞丰度较高的斑块[14]；（2）可生物降解的合成高分子化合物，如聚乳酸聚乙醇酸共聚物。通过使用以聚乳酸聚乙醇酸共聚物为材料制成的纳米颗粒，包裹他汀类药物，可延长有效药物的体内半衰期以治疗AS[15]；（3）不可生物降解材料，如碳纳米管等。

纳米材料是目前研究的新兴热点，其与传统药物相比，在对慢性代谢性疾病的治疗上更具有精准化、靶向化的优势。国内外部分研究也揭示了纳米材料可调控巨噬细胞自噬以治疗AS的效果。Han等[16]的研究显示，转换荧光纳米粒子可通过诱导急性单核细胞白血病细胞源性巨噬细胞自噬来治疗AS。体现在使用转换荧光纳米粒子后，胞内的胆固醇流出增多，ABCA-1、mTOR基因表达的蛋白含量增多，LC3-II/LC3-I 的比例升高，间接地反映该粒子可通过参与调控PI3K/Akt/mTOR 信号通路来影响自噬与脂质水平。雷帕霉素是一种常用的自噬诱导剂，主要通过抑制mTOR 复合物1 而调控PI3K/Akt/mTOR 信号通路来诱导自噬。Dou 等[17]通过把游离的雷帕霉素包装成基于乙酰化环糊精材料的可生物降解和生物相容性纳米载体，使雷帕霉素得以在体内外以良好控制的方式维持释放，且复合材料与单纯游离雷帕霉素相比，能更有效地抑制病变的炎症反应，维稳斑块，延缓AS的进展。Gao等[18]发现在近红外辐射下硫化铜—瞬时受体电位香草醛亚家族1 （copper sulfide-transient receptor potential vanilloid subfamily 1，CuS-TRPV1）可激活TRPV1 从而通过激活Ca2+-AMPK 信号通路和增加ABCA-1依赖性胆固醇外流来挽救氧化低密度脂蛋白损伤的自噬。且CuS-TRPV1 可以靶向显示容易发生AS 病变的区域，如主动脉弓、颈动脉和股动脉等，使病灶位置可视化，成为指导治疗的分子探针。Craparo等[19]通过使用与巨噬细胞CD36 受体有高亲和力的氧化磷脂1-（棕榈酰）-2-（5-酮基-6-辛烯二酰）磷脂酰胆碱来包埋雷帕霉素，形成的载药聚合物纳米粒靶向作用于巨噬细胞，进而通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路来诱导自噬治疗AS。Zhang 等[20]使用纳米二氧化硅处理小鼠单核巨噬细胞白血病细胞后，反映Beclin-1、LC3 和绿色荧光蛋白结合的LC3点状蛋白的表达显著增加，提示该材料可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬。

4 总结与展望

目前研究表明，诱导巨噬细胞自噬能促使斑块内脂质的流出、降低炎症小体水平及减少炎症因子释放等以减缓AS 的发展。使用纳米材料与传统药物相比，在AS 的治疗上展现出精准化、靶向化等优点。然而针对纳米材料本身的特性、生物安全性及其治疗AS 上的自噬机制仍有许多未知。未来探索纳米材料应用于治疗AS 的安全性、最优性及精准性均具有一定挑战。