基于PI3K/AKT/GSK3β信号通路下调miR-208a对急性心肌梗死模型大鼠的干预作用

黄晶 雷玉华 华晓芳 周慧 朱贤林

急性心肌梗死是临床中常见的一种心血管疾病，具有较高的致死率，在急性心肌梗死早期常常表现为冠状动脉急性、持续性因缺血、缺氧导致心肌细胞大量死亡，是导致患者出现心肌重构，引发心力衰竭的主要原因[1,2]。PI3K/AKT/GSK3β可以促进心肌细胞增殖分裂，活化多种效应分子，在心肌细胞的存活方面发挥着关键作用，同时可以作为治疗急性心肌梗死的关键分子靶点[3,4]。miRNA在多种心血管系统中均有表达，在心脏发育、心率失常、心肌重构、心肌细胞凋亡等病理变化中均有参与[5]。miR-208在心肌组织中显示特异性表达，具有较高的保守性。本文旨在研究基于PI3K/AKT/GSK3β信号通路研究下调miR-208a对急性心肌梗死模型大鼠的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本文选取健康、清洁级SD雄性大鼠40只，体重220～260 g，均由华北理工大学提供，合格证号:SYXK(冀)2020-007。鼠龄6～8周。大鼠均给予常规饲养，自由饮水，黑/白光照交替12 h，温度为20～25℃，湿度为40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 急性心肌梗死模型建立：本文参考李晓琳等[6]的文献建立模型：模型制备前12 h大鼠禁食，将大鼠麻醉后在胸前备皮，将大鼠头、四肢固定，腹部朝上，常规消毒。在大鼠左侧胸部第3、4肋间作横切口，肌肉层分离后，将其胸腔撑开，确定心脏位置，心包膜撕开，心脏完全暴露后，找到左冠状动脉前降支，在其2～3 mm 处使用6-0带针线穿过前降支，结扎，将切口缝合。假手术组不做结扎，只穿线。发现大鼠左心室变白，心率减缓，Ⅱ导联心电图ST段抬高，表现为弓背向上型，说明模型建立成功。40只大鼠成功37只。

1.2.2 分组及干预：37只中有10只为假手术组，其余为模型组、空白组、miR-208a转染组，每组9只。下调miR-208a通过敲低miR-208a实现，100 nmol/L转染miRNA抑制剂转染miR-208a，分为miR-208a转染组，空白组使用100 nmol/L转染miRNA抑制剂转染无意义序列，均由中共广州锐博公司提供。模型组、假手术组2组均给予等体积的生理研究干预。

1.2.3 miR-208a检测：取大鼠尾部静脉血3 ml，3 000 r/min离心10 min，取得上层血清，放置-20℃冻箱内备用。采用实时荧光定量PCR检测miR-208a表达：将采集到的100 μl血清加300 μl Trizol震荡混匀静置10 min，加80 μl氯仿再次震荡混匀静置5 min，离心后凝胶离心至管底，加100 μl DEPC水。将标本混合液15 000 r/min，离心处理15 min。提取上清至液转移到含糖原EP管中，加等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃静置2 h。提取白色沉淀加1 ml的75%乙醇，混匀后充分洗涤RNA沉淀，4℃ 7 500 g，离心处理5 min，摒弃上清液。加80 μl DEPC水对RNA沉淀进行溶解，-80℃保存。采用逆转录试剂盒(TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit)逆转成cDNA，严格按照操作说明书进行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，以外源性cel-mir-39-3p作参照，采用2-ΔΔCT法对miR-208a表达水平分析。

1.2.4 心功能相关指标检测：采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，通过超声心动图观察大鼠左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVDs)、左心室缩短分数(left ventricular shortening score，LVFS)。

1.2.5 心肌梗死面积、病理组织观察：大鼠处死后，采集大鼠心肌组织，提取后采用0.9%氯化钠溶液冲洗后，将粘附在其表面的异物清除干净，干净纱布将表面水分吸干后制备切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，染色15 min后使用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，计算大鼠心肌梗死面积。之后切片经过二甲苯脱蜡后，梯度乙醇水化，苏木精染色5 min，流水冲洗后给予伊红染色30 s，观察。

1.2.6 指标检测：ROS测定采用Fenton反应活性氧(ROS)试剂盒(南京建成生物工程研究所)完成。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)：提取标本包被液，对TGF-β 0.1 ml进行适当稀释，进而加到聚苯乙烯反应板各孔中。加盖 4℃ 24 h保存。次日使用洗涤液进行3次全方位洗涤，甩干；各孔内加不同稀释倍数的待检标本0.1 ml，同时增加阳性和阴性对照，置于43℃温箱60 min，移去液体。同上述法则洗涤3次，甩干；各孔内加稀释TGF-β 0.1 ml，置43℃温箱60 min。移去液体，同前法洗3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗处20 min；各孔内加2 mol的TGF-β 0.05 ml，终止反应。试剂盒购自北京北方生物技术研究所，试验操作严格根据说明书上的步骤进行。采用免疫印迹(Western blot)将标本提取液，利用1 000 r/min速率离心处理提取液，然后加入裂解液，进行反复冻融后以120 000 r/min再次离心处理，提取上清液，再利用酶标仪检测PI3K、AKT、GSK3β蛋白浓度，保存后静置。加入10%的分离胶，封闭，吸干水分，灌注5%的浓缩胶，凝固成功后置于电泳槽中将其固定，最后加入5 μl Marker和变性蛋白样品，电泳30 min，将蛋白分离胶底后结束电泳，砖模成功后加入5%的脱脂奶粉进硝酸纤维素膜(Nitrocellulosefilter membrane，NC)膜中，封闭固定1 h，加入一抗(PI3K、AKT、GSK3β 1∶1 000)孵育，经过震荡洗膜后加二抗(PI3K、AKT、GSK3β 1∶10 000)，孵育，再次震荡洗膜，最后以GAPDH为内参，使用红外荧光成像系统对结果给予分析。

2 结果

2.1 4组大鼠miR-208a表达比较 miR-208a转染组miR-208a表达低于模型组、空白组，高于假手术组(P<0.05)；模型组、空白组miR-208a表达均高于假手术组(P<0.05)；模型组、空白组miR-208a表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组大鼠miR-208a表达比较

2.2 4组大鼠心功能相关指标比较 miR-208a转染组LVEF、LVFS高于模型组、空白组，低于假手术组(P<0.05)；LVDd、LVDs低于模型组、空白组，高于假手术组(P<0.05)；模型组、空白组LVEF、LVFS低于假手术组，LVDd、LVDs高于假手术组(P<0.05)；空白组LVEF、LVFS高于模型组，LVDd、LVDs低于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠心功能相关指标比较

2.3 4组大鼠病理组织观察 假手术组大鼠心肌细胞表现为杆状、细长，横纹肌表现正常，细胞排列整齐；模型组大鼠梗死区域较薄，心肌细胞明显减少，细胞排列紊乱，细胞肿胀，血管有明显的充血，有大量炎性细胞浸润。空白组细胞排列、肿胀等方面明显改善。miR-208a转染组大鼠细胞排列恢复整齐，细胞肿胀、炎性浸润消失。见图1。

图1 4组大鼠病理组织观察(HE染色×200)

2.4 4组大鼠心肌梗死面积比较 miR-208a转染组心肌梗死面积低于模型组、空白(P<0.05)；空白组心肌梗死面积低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠心肌梗死面积比较

2.5 4组大鼠ROS、TGF-β水平比较 miR-208a转染组ROS、TGF-β水平低于模型组、空白组，高于假手术组(P<0.05)；模型组、空白组ROS、TGF-β水平分别高于假手术组(P<0.05)；空白组ROS、TGF-β水平低于模型组(P<0.05)。见表4。

表4 4组大鼠ROS、TGF-β水平比较

2.6 4组大鼠PI3K/AKT/GSK3β信号通路相关指标比较 miR-208a转染组PI3K、AKT、GSK3β表达低于模型组、空白组，高于假手术组(P<0.05)；模型组、空白组PI3K、AKT、GSK3β表达高于假手术组(P<0.05)；空白组PI3K、AKT、GSK3β表达低于模型组(P<0.05)。见表5,图2。

表5 4组大鼠PI3K/AKT/GSK3β信号通路相关指标比较

图2 4组大鼠PI3K/AKT/GSK3β信号通路相关指标比较(WB图)

3 讨论

研究指出急性心肌梗死发病会导致机体中定居型巨噬细胞数量增加，脾脏会释放大量的聚集型巨噬细胞、炎性细胞、中性粒细胞以及单核细胞等大量在梗死部位聚集，造成炎性反应，心肌损伤的速度不断加快[7,8]。急性心肌梗死发病过程是心肌不断坏死的过程，目前实验研究主要采用冠状动脉左前降支结扎术建立急性心肌梗死模型，主要是其病理变化与实际贴近[9]，使得实验结果更加科学。

miR-208a通过调节肌球蛋白基因表达，参与肌肉生理、病理信号反应过程，具有心脏特异性，只在心脏中表达[10]。陈耽等[11]研究指出，miR-208a抑制剂通过下调β-MHC表达，能控制高血压大鼠心功能障碍发展过程。在再灌注损伤大鼠中miR-208a表达较高，在缺血后处理大鼠中表达下降，β-MHC基因表达的高低与miR-208a表达呈正相关[12]。本文研究结果显示，在急性心肌梗死模型大鼠中，miR-208a表达较高，miR-208a转染组miR-208a表达降低，提示miR-208a转染成功。经过miR-208a转染干预，急性心肌梗死模型大鼠LVEF、LVFS升高，LVDd、LVDs降低，说明miR-208a转染能改善大鼠心功能相关指标，促进大鼠心功能恢复。本文中miR-208a转染能缩小急性心肌梗死模型大鼠心肌梗死面积，从而改善大鼠心肌病变的严重程度，大鼠心肌组织炎性细胞浸润状况也得到显著的改善。

当心肌梗死发生时，因心肌细胞氧代谢障碍，线粒体功能失衡等影响，导致大量的ROS产生，因为蛋白质发生氧化损伤，引发心功能变化，在急性心肌梗死中伴有大量的肌钙蛋白、肌动蛋白提升，是由于ROS损伤心肌细胞导致[13,14]。TGF-β参与心肌重构、心肌纤维化等过程，对心脏成纤维细胞迁移有明显的诱导作用，将促纤维化程序激活[15,16]。本文研究结果显示，miR-208a转染能降低ROS、TGF-β水平，从而起到减轻大鼠心肌损伤、心肌纤维化的作用。

相关研究表明，PI3K/AKT/GSK3β通路会促进心肌组织的纤维化，其上调会损害心肌细胞[17-19]，其会参与急性心肌梗死的发病过程。本研究结果显示，miR-208a转染能明显能下调PI3K、AKT、GSK3β水平，抑制PI3K/AKT/GSK3β通路，进而抑制心肌细胞凋亡，降低缺血灌注及缺血引发的心肌组织损伤，最终起到保护大鼠心肌细胞的作用。另外，PI3K/Akt/GSK3β通路被激活后，TGF-β、Hes1、HIF-1α等炎性因子会被进一步释放，炎性反应加剧[20,21]。而miR-208a转染在抑制PI3K/Akt/GSK3β通路后，也会减轻机体炎性反应，缓解心肌损伤。

综上所述，下调miR-208a可以抑制PI3K/Akt/GSK3β信号通路相关蛋白，进而抑制心肌细胞凋亡，缓解机体炎性反应，保护机体心肌细胞，最终减缓心肌损伤程度，同时也能改善急性心肌梗死模型大鼠心功能，减少心肌梗死面积，为临床急性心肌梗死靶向治疗提供依据。