白茶寡肽的抗氧化活性研究

王小娟，刘 慧，王良瑄，吴文晞，赵 峰*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建恒正检测技术有限公司，福建 福州 350199；3.福建省中药资源重点实验室，福建 福州 350122）

白茶属于微发酵茶，是中国六大茶类之一，其不经杀青与揉捻，具有外形芽毫完整，满身披毫，滋味清甜回甘等特点。白茶主产于福建福鼎、政和、松溪等地［1］，可分为白毫银针、白牡丹、寿眉、贡眉四个品类［2］。白茶的药性价值好，具有解酒醒酒、清热润肺、平肝益血、消炎解毒、降压减脂、消除疲劳等功效［3］。

目前对于白茶功效性成分研究多集中于茶多酚，咖啡碱以及多糖等物质。寡肽是一种小分子量的蛋白质，是由2～10个氨基酸连接而成，分子量在2000 Da以内。现代研究表明，寡肽具有易吸收的特点，而且不同氨基酸序列的寡肽具备潜在的抗氧化、降血压、降血糖、降血脂、免疫调节等作用［4-8］。近年的研究显示，白茶加工过程中长时间的萎凋有利于茶叶蛋白质的降解和寡肽的富集［9］。最新的研究显示，白茶中寡肽含量达6%～8%，超过游离氨基酸总量，高于其他参试茶类（红茶、绿茶、黄茶和乌龙茶）［9,10］。但目前尚未见任何对白茶寡肽活性的实验性研究。本研究旨在通过白茶寡肽的制备、测序和抗氧化活性研究，进一步了解白茶寡肽对白茶保健功效贡献的作用，以期为寡肽活性的进一步研究奠定基础，也为将来相关功能性产品的开发提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白茶（一级白牡丹，福建政和，2021年5月产，购自福州水木年茶文化传播有限公司）；无水乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、叔丁基过氧化氢（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；3,5-二硝基水杨酸、Western及IP细胞裂解液（分析纯，上海源叶生物技术有限公司）；DMEM高糖培养基［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；胎牛血清［依科赛生物科技（太仓）有限公司］；0.25%胰酶、双抗（博士德生物工程有限公司）；蛋白浓度（BCA）测定试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物研究工程所）；正戊烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、二甲基亚砜（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）。

电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HY-2漩涡混匀仪（上海仪分科学仪器有限公司）；P5型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；电热恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；BHS系列水浴锅（宁波群安实验仪器有限公司）；分液漏斗振荡器（上海佳邦电子有限公司）；CO2培养箱［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；多功能微孔板酶标仪［帝肯（上海）贸易有限公司］；FD-1C-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；FlowMem0021-HP三联高压平板膜（厦门福美科技有限公司）。

1.2 白茶寡肽制备

参照 MATHIAS S［11］和刘慧［12］的方法，制备白茶寡肽。具体步骤如下：白茶粉碎后，以300 mL正戊烷分5次浸泡脱脂，300 mL无水乙醇分5次回流提取（氨基酸及寡肽可溶于乙醇，而多糖、高分子量水溶性蛋白质则不溶），合并提取液，滤液40℃下真空旋蒸后，以100 mL纯水转溶，再依次分别使用二氯甲烷，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯进行液液萃取（每种溶剂萃取5次，每次200 mL），取水相，40℃下旋蒸去除残余有机溶剂后，冷冻干燥，以500 Da超滤膜浓缩后，取截留物（即＞500 Da）冻干后得白茶寡肽，-20℃保存。

1.3 白茶寡肽纯度检验

定量测定白茶寡肽中茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸总量和总糖，检验其纯度。具体步骤为：称取10 mg白茶寡肽，超纯水溶解后定容至100 mL；取适量，按照GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、GB/T 8312-2013《茶 咖啡碱测定》、GB/T 8314-2013《茶 游离氨基酸总量的测定》和3,5-二硝基水杨酸（DNS）［13］比色法测定总糖。

1.4 白茶寡肽高通量测序

按照ZHAO F等的方法［9,10］对寡肽进行测序。

前处理方法：称取白茶寡肽0.1 g（精确到0.001 g）于50 mL离心管，加入15 mL 50%（v/v）甲醇，涡旋，放入70℃水浴锅中15 min，取出，冷却至室温，过0.22 μm滤膜，使用Q-Exactive超高压液相色谱-四极轨道超高分辨质谱（Thermo Scientific，USA）鉴定白茶寡肽中的肽段种类。

液相色谱条件：Acquity UPLC CSH C18柱（内径2.1×100 mm，粒径1.7 μm）；流动相由流动相A［Milli-Q水（含0.2%甲酸）］和流动B［乙腈（含0.2%甲酸）］组成；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30℃；样品进样量：10.0 μL；洗脱梯度为：0-5 min 98%A；5-30 min 98%A→ 80%A，30-60 min 80%A→20%A，60-90 min 20%A→5%A，90-95 min 5%A 和 95.1-105 min 98%A。

质谱条件：正离子模式；MS/top10 dd-ms2；一级质谱分辨率70000；二级质谱分辨率，17500；喷雾电压3.50 kv；毛细管温度320℃；辅助气体加热器温度411℃；鞘层气体流速（N2）40 L·h-1；辅助气体流速（N2）15 L·h-1。

质谱数据由Xcalibur 2.2 SP2 软件（Thermo Scientific，USA）采集；寡肽序列拼接，由蛋白质组学软件Peaks Studio 8.5（Bioinformatics Solutions,Canada）通过一级母离子精确分子量及对应二级碎片的a离子，b离子，y离子等的解析完成；茶树蛋白质数据库：Tea tree protein.fasta［14］；一级母离子允许偏差，15 ppm；二级碎片离子允许偏差，0.02 Da；肽段筛选，按照ALC（平均置信度）分值≥90且-10logP≥20。

1.5 鉴定肽段活性预测及溶解性评估

根据文献［15］，按照表1标准对所鉴定寡肽活性的抗氧化活性进行评分预测。使用网站工具（http://www.chinapeptides.com/tool.aspx）检索所鉴定肽段的亲水残基占比和平均亲水性，从而评估其溶解性。

表1 抗氧化活性预测评分规则Table 1 Guidelines for scoring predicted antioxidant activity

1.6 体外抗氧化能力评价

1.6.1 DPPH自由基清除能力

参照郑景如等［16,17］以及刘慧等［17］的方法并略作改进，在室温条件下，向96孔板中逐一加100 μL 0.6 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液后，再分别加入100 μL样液，100 μL甲醇，100 μL DPPH溶液，混匀后，在暗处反应30 min，于517 nm波长下测定吸光度（A）。以还原性谷胱甘肽溶液（同等浓度）做对照、纯水作空白，根据公式（1）计算DPPH自由基清除能力，根据公式（2）计算样品的抗氧化能力（AO值）。每个样品重复3次，结果取平均值。

注：IC50（样品）为样品的半抑制浓度（半数清除率）；IC50（谷胱甘肽）为谷胱甘肽的半抑制浓度。

1.6.2 羟自由基清除能力

参照XU Y等［18］的方法并略作改进，在10 mL试管中依次加入1 mL 6 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL不同浓度的样品溶液、1 mL 6 mmol·L-1H2O2溶液，启动反应，于室温中静置10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水杨酸溶液作为捕获剂，室温静置30 min，取200 μL上清液于96孔板中，用酶标仪在510 nm波长下测定吸光度。阳性对照组用还原性谷胱甘肽（同等浓度）代替样品，空白组用超纯水代替H2O2，对照组用水代替样品，根据公式测定清除羟自由基能力。每个样品重复3次，结果取平均值。

1.6.3 总还原力

参照LU C等［19］的方法并略作改进，在10 mL离心管中依次加入0.5 mL不同浓度的样品溶液，0.5 mL磷酸缓冲溶液（0.2 mol·L-1，pH 6.6），2.5 mL 1%的铁氰化钾，于50℃水浴20 min，再加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，3000 r·min-1离心10 min。取100 μL上清液与70 μL超纯水以及70 μL 0.1%三氯化铁于96孔板中，室温反应10 min，用酶标仪在700 nm波长下测定吸光度。阳性对照组用还原性谷胱甘肽（同等浓度）代替样品，空白组用超纯水代替样品，根据公式测定总还原力。每个样品重复3次，结果取平均值。

总还原力＝A样品-A空白

1.7 细胞抗氧化能力评价

1.7.1 细胞培养

将HepG2细胞于37℃恒温水浴锅中进行复苏，加入一定量的培养基（DMEM高糖培养基＋10%胎牛血清＋1%双抗），1200 r·m-1离心3 min，随后将细胞转移至25 cm2培养瓶内，于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养，待细胞贴壁生长至80%～90%时，以1∶3进行传代。

1.7.2 细胞毒性实验

参照张燕［20］等方法并略作改进，将处于对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板中，每个孔内细胞数约5×104个，向每孔中加入100 μL培养基，在37℃、5% CO2条件下培养24 h，向每孔中加入100 μL用培养基配制的不同浓度的白茶寡肽溶液，每组设置6个复孔，培养24 h后，向每孔加入100 μL浓度为1 mg·mL-1的噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）溶液，培养4 h，吸出MTT溶液，向每孔加入200 μL DMSO溶液，震荡10 min，在490 nm波长下测定吸光度，空白组不加细胞，对照组用培养基替代样品，重复以上操作，并按照以下公式测定细胞存活率：

1.7.3 氧化应激细胞模型的建立

参照CHANG X［21］等的方法并略作修改，选择不同浓度的H2O2对于HepG2细胞处理4 h，以细胞存活率为指标，选择细胞存活率为60%的H2O2浓度作为诱导条件，细胞存活率采用MTT测定法。

1.7.4 HepG2细胞中SOD活性的测定

参照SOD试剂盒说明书，向上述的96孔板中加入一定量的细胞裂解液，用微量移液器吸出待测。另取一96孔板，分别加入20 μL待测样本，20 μL酶工作液以及200 μL底物应用液。混匀，37℃孵育20 min，450 nm处酶标仪测定。对照组用蒸馏水代替待测样本，对照空白组用蒸馏水代替待测样本，酶稀释液代替酶工作液，每个样品重复3次，结果取平均值。

1.8 数据分析

实验数据结果以平均值±标准差（x±SD）表示，采用Excel 2019和SPSS 25.0对实验数据进行差异显著性分析及单因素方法分析，以Origin 2021进行绘图。

2 结果与分析

2.1 白茶寡肽纯度

白茶寡肽的得率为3%，纯度检验结果显示，茶多酚含量＜0.9 mg·g-1，咖啡碱含量＜1.5 mg·g-1，游离氨基酸含量＜1.5 mg·g-1，总糖未检出（DNS法的检出限为2.0 mg·g-1）。即，白茶寡肽中茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸以及总糖的残留量均小于0.2%。

2.2 白茶寡肽测序及活性预测

根据肽段鉴别标准［平均局部置信区间（ALC≥90）及-10logP≥20］，从白茶寡肽中共鉴别到44条肽段，其对应的质谱信号强度、亲水残基占比、平均亲水性和抗氧化力预测值如表2所示。结果可知，上述寡肽中疏水性基团的占比较高，特别是亮氨酸（L）和异亮氨酸（I）的占比较高，表明其潜在较强的抗氧化能力［22,23］。此外，已知规律显示，当氨基酸序列中含有天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、酪氨酸（Y）以及甘氨酸（G）时，肽链会具有突出的抗氧化潜力。表2的评分结果显示，经筛选的白茶寡肽氨基酸序列的抗氧化活性评分多处于4.5～5.5分，其中抗氧化评分最高的氨基酸序列为LLILLIIII，为7.5分。

表2 白茶寡肽序列质谱信号强度、亲水残基占比、平均亲水性和抗氧化力预测值Table 2 Relevant information on identification of white tea oligopeptides

注：1亲水残基比例指多肽序列中亲水性氨基酸残基数占总残基数的百分比。2平均亲水性是根据多肽序列中各氨基酸残基以及不同修饰的亲/疏水值来得到的。从一条肽的平均亲水性值，可以判断其在水的溶解性如何。

2.3 白茶寡肽链长以及分子量分布

对全部鉴定到的寡肽的链长和分子量分布区间进行统计，由图1可知，全部44条肽中最短的肽为四肽，最长的肽为十三肽。从肽段的数量和占比上看，以四肽最多，共12条，占比28.6%；其次为九肽，共9条，占比21.4%。从分子量分区区间看，所提取的白茶寡肽多集中于300～500 Da区间，其次为900～1100 Da区间。

图1 鉴定肽段构成特征分析Fig. 1 Characterization of identified peptides

2.4 白茶寡肽的体外抗氧化能力评价

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH在无水乙醇中呈深紫色，当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长517 nm处的吸光值随之减小，可以评价供试样品提供电子对能力的强弱，进而表征其抗氧化能力［19］。由图2可知，在0～0.5 mg·mL-1的测试浓度范围内，其对自由基的清除能力呈快速直线上升，至0.5 mg·mL-1时为最高（达91.86%），之后随浓度增加，清除率未见明显改变。

图2 白茶寡肽对DPPH自由基的清除能力Fig. 2 DPPH free radical scavenging ability of white tea oligopeptides

白茶寡肽的IC50为0.170 mg·mL-1，谷胱甘肽的IC50为0.126 mg·mL-1，即，白茶寡肽的DPPH自由基清除能力基本接近于谷胱甘肽。根据GB/T 39100-2020《多肽抗氧化性测定 DPPH和ABTS法》计算白茶寡肽AO值，得出白茶寡肽的AO值为1.350。

2.4.2 羟自由基清除能力

羟自由基是人体在形成代谢过程中产生最活泼、危害最大的自由基之一，可使氨基酸、蛋白质、核酸等物质遭受氧化性损伤和破坏，进而导致细胞损伤［24］。图3显示，在试验浓度范围内，白茶寡肽的羟自由基清除能力平稳上升，呈现浓度依赖性。当寡肽粗提物浓度达到1.2 mg·mL-1时，其羟自由基清除能力为54.93%。计算后可知，白茶寡肽的羟自由基清除能力的IC50为0.850 mg·mL-1，而谷胱甘肽的羟自由基清除能力的IC50为1.816 mg·mL-1，说明白茶寡肽的羟自由基清除活性远超谷胱甘肽。

图3 白茶寡肽对羟自由基的清除能力Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging ability of white tea oligopeptides

2.4.3 总还原力

还原力的大小可以表示抗氧化物质供给电子的能力，还原能力大的样品就是很好的电子供体。通过提供电子可使自由基转变为稳定的物质，进而可中断自由基的连锁反应［25］。利用铁氰化钾还原法测定白茶寡肽的总还原力，且还原力与吸光度成正相关，即吸光度越大，白茶寡肽总还原力越强，抗氧化能力也越强。由图4得知，在试验浓度范围内，白茶寡肽的总还原力呈现一定的增长趋势，当浓度为500 μg·mL-1时，吸光度最大（达1.033），总还原力最强，表明其抗氧化能力也最强。

图4 白茶寡肽的总还原力Fig. 4 Total reducing power of white tea oligopeptides

2.5 白茶寡肽在细胞水平的抗氧化能力评价

2.5.1 白茶寡肽作用于HepG2细胞的浓度筛选

由图5可知，白茶寡肽浓度为100～1000 μg·mL-1范围时，HepG2细胞的存活率呈现了先下降再上升最后下降的趋势。白茶寡肽浓度为100～800 μg·mL-1的范围内，HepG2细胞存活率均大于80%，说明白茶寡肽浓度在100～800 μg·mL-1范围内对细胞无明显毒性。当白茶寡肽浓度为1000 μg·mL-1时，细胞存活率为74.47%，细胞增长受到明显抑制。因此选用白茶寡肽浓度为100、300、500 μg·mL-1进行后续试验。

图5 不同浓度白茶寡肽对HepG2细胞的毒性作用Fig. 5 Toxicity of white tea oligopeptides in varied concentrations on HepG2 cells

2.5.2 HepG2氧化应激细胞模型的建立

由图6可知，随着H2O2浓度的不断上升，细胞存活率总体趋势是不断下降的（P＜0.05）。在一般细胞模型的药物筛选中，选择细胞存活率为50%～70%的浓度为诱导浓度。当H2O2的浓度为500 μmol·L-1时，细胞存活率为61.37%。与对照组相比，当H2O2的浓度为600 μmol·L-1时，细胞存活率仅为40.98%（P＜0.01），存活率显著下降，H2O2浓度太高可能会对细胞产生不可逆损伤，因此确定以500 μmol·L-1为诱导浓度，开展后续试验。

图6 不同浓度H2O2对HepG2细胞存活率的影响Fig. 6 Effects of hydrogen peroxide in varied concentrations on viability of HepG2 cells

2.5.3 白茶寡肽对HepG2氧化应激模型的保护作用

图7所示是不同浓度白茶寡肽处理后的HepG2细胞形态，从形态角度可以直观地观察到H2O2损伤及寡肽的保护作用。具体地看，图7-B中正常组细胞呈梭形状，排布均一；而图7-A中模型组细胞形态变圆，细胞间隙变大且有部分细胞脱落；图7-C为白茶寡肽100 μg·mL-1给药组，与模型组相比，其细胞形态几乎一致，但其细胞间隙变小，且无细胞脱落现象，表明低浓度白茶寡肽，未能对H2O2诱导HepG2氧化应激细胞模型产生明显保护。图7-D、7-E分别为白茶寡肽300 μg·mL-1和500 μg·mL-1的给药组，与模型组比较发现，细胞形态逐渐变为梭形，排布也逐渐紧密，表明上述浓度的寡肽，开始对H2O2诱导HepG2氧化应激细胞模型产生明显的保护。

图7 不同浓度白茶寡肽处理经H2O2诱导的HepG2细胞形态Fig. 7 Morphology of HepG2 cells induced by H2O2 and treated with white tea oligopeptides in varied concentrations

SOD是生物体系中抗氧化酶的重要组成部分，其可保护细胞、机体免受氧化损伤。因此，本研究还测定了细胞体系的SOD酶活性（图8）。可知，与正常组相比，模型组的SOD活力显著降低（P＜0.05）。即，细胞在500 μg·mL-1H2O2处理下发生了氧化损伤。但随后，伴随白茶寡肽给药浓度的增加，细胞内的SOD活力也开始上升；当寡肽浓度为300、500 μg·mL-1时，与模型组相比，其抗氧化水平呈现显著性差异（P＜0.05），且与正常组相比，已不存在显著性差异（P＞0.05）。表明白茶寡肽对H2O2诱导的HepG2氧化应激细胞模型具有保护作用，且呈现浓度依赖性。

图8 不同浓度白茶寡肽对H2O2诱导的HepG2细胞中SOD的影响Fig. 8 Effects of white tea oligopeptides in varied concentrations on SOD activity of H2O2-induced HepG2 cells

3 讨论与结论

近年来，白茶因其有助于人体健康的特性受到人们的关注。最近的研究表明［26,27］，白茶具有独特的抗氧化活性，饮用白茶可以减轻氧化应激作用。本研究通过分析白茶寡肽的氨基酸序列发现，白茶寡肽的氨基酸排布会影响白茶寡肽的抗氧化活性，疏水性氨基酸以及酸性氨基酸能增强白茶寡肽的抗氧化能力。并且通过体外抗氧化评价实验，发现白茶寡肽的抗氧化能力总体呈现浓度依赖性。

ZHAO F［10］等研究了白茶萎凋过程中寡肽的变化，发现白茶长时萎凋有助于寡肽的富集，且鉴定的白茶寡肽多集中于短肽。分子量小的寡肽因为本身性质使其更易被人体所吸收，能够直接参与人体代谢活动［28］。白茶寡肽构成以低分子量为主，表明其潜在的优异抗氧化能力。本研究结果表明，白茶寡肽有着显著的抗氧化能力，拥有较强的DPPH自由基清除率以及羟自由基清除率，总还原能力实验也表明了白茶寡肽具有优良的抗氧化能力，并且通过细胞实验也验证了白茶寡肽的抗氧化能力。

肽的结构特性、电子分布、氢键等分子特征都可能影响到肽段的抗氧化活性［29］。GIMENEZ B［30］等报道了酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）可以通过金属螯合能力进而增强肽的抗氧化能力。ZHU Z［31］等报道了甘氨酸因其侧链拥有一个氢离子，可以与金属产生螯合作用，所以可能在抗氧化活性方面发挥着至关重要的作用。TSOPMO A［32］等报道了酪氨酸结构中含有芳香环以及额外的-OH，有助于其与金属离子的螯合作用以及增强自由基清除能力，可能使酪氨酸拥有较强的抗氧化能力。FENG L［33］等研究表明当酪氨酸位于肽链中的C-端或N-端时，酪氨酸能够通过从酚基团中提供一个氢原子，从而使拥有酪氨酸的肽链表现出较强的抗氧化能力。本研究结果表明，从白茶寡肽中鉴定出的氨基酸序列中存在天冬氨酸、酪氨酸以及甘氨酸时，肽链的抗氧化能力会增强，推测白茶寡肽的抗氧化能力与其氨基酸序列有着密切的关系。未来可从白茶寡肽的氨基酸构成层面上，进一步研究白茶寡肽的抗氧化能力。

本研究首次成功制备了白茶寡肽，通过高分辨质谱探究了白茶寡肽的构成氨基酸序列，并进一步通过DPPH自由基清除实验、羟自由基清除实验、总还原力实验和HepG2细胞氧化应激保护能力实验，揭示白茶寡肽具备优异的抗氧化能力。上述研究结果将有助于我们从寡肽构成的角度进一步了解白茶活性的物质基础，进而推动白茶医药和功能性产品的开发。