斜纹夜蛾蜕皮激素合成通路相关CYP450基因的鉴定及表达分析

谷 峻,叶 艳,李时宇,袁雅菲,黄立华

(华南师范大学生命科学学院,广东省昆虫发育生物学与应用技术重点实验室,广州 510631)

斜纹夜蛾Spodopteralitura属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，最早起源于印度和东南亚地区。目前，斜纹夜蛾主要分布于亚洲的热带和亚热带地区，包括印度、中国和日本。斜纹夜蛾寄主范围广泛，可为害100多种作物(Ferryetal.,2004)。除此之外，斜纹夜蛾生活周期短，繁殖能力强，并且对很多种化学杀虫剂(Sparks and Nauen,2015)以及苏云菌芽孢杆菌Bacillusthuringiensis毒素都产生了抗性(Wanetal.,2008)。这些特性使得斜纹夜蛾能对农作物造成较大的为害。在印度，斜纹夜蛾通常造成10%～30%的作物损失(Ferryetal.,2004)。斜纹夜蛾是一种典型的完全变态类昆虫，其一生要经历卵、幼虫、蛹和成虫4个不同的发育阶段。由于幼虫和成虫外部形态完全不同，因此这种发育方式称为“变态发育”。在变态发育过程中，许多幼虫的器官或组织，如表皮、中肠和脂肪体等在蛹期要解体，并重新生成相应的成虫器官或组织。昆虫的变态发育主要受两种激素调控，包括保幼激素(juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(ecdysone)，前者使昆虫保持幼体的形态，而后者诱导昆虫蜕皮和变态。

昆虫自身不能从头合成蜕皮激素，只能利用从取食植物中获得的甾醇来合成蜕皮激素，并最终转变为有活性的20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)。昆虫蜕皮激素合成的每一步反应几乎都依赖于一类特殊的酶——细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)。CYP450是一个古老的以血红素为辅基的B族细胞色素蛋白酶基因超家族，广泛存在于细菌、真菌、植物以及动物等各种生物体内(Omura,1999)。CYP450在昆虫中的作用主要包括两大方面：一是参与对外源物质(植物次生代谢产物、杀虫剂)的转化与降解，使昆虫对寄主的有毒性物质产生耐受性；二是催化体内生长发育过程所需物质(蜕皮激素、保幼激素、脂肪酸、性激素等)的合成与代谢，调节昆虫的生长发育、变态和繁殖过程(Werck-Reichhart and Feyereisen,2000)。

昆虫蜕皮激素是由一系列CYP450负责合成的，这些CYP450包括CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1,CYP315A1,CYP314A1以及CYP18A1(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)。其中，CYP307A1负责将植物甾醇的初级代谢产物7-dehydrocholesterol转化为Δ4-diketol；后者经过一系列的代谢转化为5β-ketodiol，并在CYP306A1的作用下转化为5β-ketotriol；CYP302A1负责将5β-ketotriol转化为2-deoxyecdysone，它随后在CYP315A1的作用下转化为蜕皮激素；最后由CYP314A1将蜕皮激素转变为活性更高的20E(Nakagawa and Sonobe,2016)，而CYP18A1负责降解20E(Guittardetal.,2011)。已有大量的证据显示这些CYP450基因在昆虫变态发育过程中起着非常重要的作用。例如，在沙漠蝗虫Schistocercagregaria中抑制CYP307A1和CYP306A1的表达将显著降低蜕皮激素的浓度，并破坏幼虫蜕皮过程(Marchaletal.,2011)。CYP314A1是负责20E合成最后一步的关键酶，在小菜蛾Plutellaxylostella中通过RNAi抑制其基因的表达会使得幼虫发育时期延长，化蛹率降低(Pengetal.,2019)。在果蝇Drosophila中抑制CYP18A1的表达会造成蜕皮延后以及蛹致死(Petryketal.,2003)。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性、长度为22～23 nt的非编码RNA。越来越多的研究表明，miRNA在调控昆虫变态发育方面起着重要的作用。在斜纹夜蛾中肠组织中鉴定出了101种miRNA，其中75种miRNA在变态发育过程中呈现出显著的差异表达，并且它们可以靶向蜕皮激素信号通路中的多个基因，从而对蜕皮激素信号传导产生调控(Luoetal.,2020)。

尽管CYP450在昆虫蜕皮激素合成代谢过程中的作用已经比较清楚，但是这些CYP450基因在昆虫变态发育过程中的表达规律仍缺乏详细的研究。本研究将以我国重要农业害虫斜纹夜蛾为研究材料，检测负责20E合成代谢的6个CYP450基因的发育和组织表达谱，以及取食不同寄主植物对CYP450基因表达的影响，并预测靶向这些CYP450基因的miRNA。该研究将有助于明确影响20E合成代谢通路中的关键基因，从而为害虫防治提供潜在的作用靶标。

1 材料与方法

1.1 试虫

斜纹夜蛾幼虫来自中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，按照Huang等(2011)的方法在本实验室中稳定传代培养。

1.2 激素合成代谢通路相关CYP450基因的鉴定

以家蚕BombyxmoriCYP450基因(https:∥drnelson.uthsc.edu/silkworm.pub.htm)为查询序列，通过blast P在线软件(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)从斜纹夜蛾基因组(GenBank登录号:ASM270686v1)中检索出相似性最高的CYP450基因，并根据家蚕CYP450基因的名称给予相应的命名。

1.3 系统发育分析

为进一步揭示这些CYP450基因之间的系统进化关系，用Cluster X软件(Thompsonetal.,1997)比对1.2节鉴定出的斜纹夜蛾CYP450基因和家蚕全部82个CYP450基因，然后用MEGA软件(7.0.18版本) (Kumaretal.,2016)，采用邻接(neighbor-joining,NJ)法用P-distance模型来构建其编码蛋白的系统进化树。建树过程中两两比对缺失的氨基酸被排除在外。根据1 000次重复来获得bootstrap值，用于衡量分支的可靠性。

1.4 喂食寄主植物

取30头刚从3龄蜕皮进入4龄的斜纹夜蛾幼虫，放置于长×宽=30 cm×10 cm的塑料养虫盒中，喂食种植1～2个月的寄主植物(辣椒Capsicumannuum、黄瓜Cucumissativus、番薯Ipomoeabatatas和花生Arachishypogaea)叶片，视取食情况及时添加新的叶片，直到所有幼虫都化蛹，喂食人工饲料(孙庚等,2015)作为对照。记录每头幼虫从4龄第1天发育至化蛹所经历的时间，作为取食寄主植物后幼虫的发育历期。每种寄主植物喂食30头，实验重复3次。

1.5 qPCR检测基因表达量

参照我们以往的研究(Guetal.,2003)，分别收集斜纹夜蛾6龄幼虫、预蛹和蛹，并在冰上分别解剖中肠、表皮和脂肪体组织。设3个生物学重复，每个重复样品中包括至少3头个体。收集1.4节喂食实验中发育至5龄中期的幼虫，按同上方法解剖其中肠组织。采用Primer Premier (http:∥www.premierbiosoft.com/primerdesign/)为1.2节中鉴定出的CYP450基因和内参基因EF-1α(GenBank登录号:KC007373)设计相应的qPCR引物(表1)，并由广州擎科生物技术有限公司合成。采用RNAprep Pure Tissue Kit (天根生物技术公司,北京)提取样品的总RNA，并采用On-Column DNase (QIAGEN Inc.,Valencia,CA,美国)去除残留的微量基因组DNA。取1 μg总RNA，反转录成cDNA。qPCR参考Hu等(2016)采用SYBRVR Premix EX TaqTMMaster Mixture (TaKaRa,大连)，并在ABI7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems,Foster City,CA,美国)上进行PCR反应。PCR反应程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,40个循环；熔解曲线:95℃ 15 s;60℃ 30 s,95℃15 s。定量PCR的结果采用2-ΔΔCt法分析(Livak and Schmittgen,2001)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 靶向CYP450基因的miRNA预测

MiRNA参与变态发育过程中多个蜕皮激素信号通路基因的表达调控(Luoetal.,2020)。为探究miRNA是否也参与蜕皮激素合成通路基因的表达调控，我们分别利用4种不同软件PITA(https:∥genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/index.html),miRanda(http:∥www.microrna.org/microrna/getDownloads.do),microTar(http:∥tiger.dbs.nus.edu.sg/microtar/)和RNAhybrid(https:∥bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)预测能够靶向P450基因的miRNA，预测阈值分别设置为：score≥130(miRanda)，ddG≤-10 (PITA)(Candianietal.,2011;Bondaneseetal.,2014)，energy≥0.5(microTar)(Liuetal.,2018)，ΔG≤-20(RNAhybrid)(Candianietal.,2011)。为了提高预测的精准度，只有同时被3种及3种以上方法预测到的miRNA才能最终采纳。

1.7 数据分析

应用SPSS软件(SPSS Inc.,Chicago,美国)对实验数据进行统计分析。采用ANOVA中的LSD模型来分析差异显著性。

2 结果

2.1 鉴定到的斜纹夜蛾蜕皮激素合成代谢通路相关CYP450基因

鉴定出了蜕皮激素合成代谢通路相关的6个直系同源CYP450基因CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1,CYP315A1,CYP314A1和CYP18A1(表1)，这些基因均编码大约500个氨基酸，具有2～11个不等的外显子。

系统进化树显示，这6个CYP450基因归为两个亚家族，其中，CYP307A1,CYP306A1和CYP18A1属于CYP2亚家族，CYP302A1,CYP315A1和CYP314A1属于线粒体CYP(mitochondrial CYP,MtCYP)亚家族(图1)。

图1 邻接法构建的基于氨基酸序列的蜕皮激素合成代谢通路相关CYP450蛋白的系统进化树(1 000次重复)Fig.1 Phylogenetic tree of CYP450 proteins involved in the ecdysone synthesis pathway based on the amino acid sequences using the neighbor-joining method (1 000 repeats)蛋白来源物种和GenBank登录号Origin species of proteins and their GenBank accession numbers:BmCYP307A1:家蚕Bombyx mori,BAH47267;Sl_CYP307A1:斜纹夜蛾 Spodoptera litura,XP_022833232;BmCYP305B1:家蚕B. mori,BAM73852;BmCYP15C1:家蚕B. mori,C0SPF7;BMCYP303A1:家蚕B. mori,XP_004932789;BmCYP306A1:家蚕B. mori,NP_001106222;Sl_CYP306A1:斜纹夜蛾 S. litura,XP_022819702;BmCYP18A1:家蚕B. mori,NP_001077078;BmCYP18B1:家蚕B. mori,XP_004923216;Sl_CYP18A1:斜纹夜蛾 S. litura,XP_022819704;BmCYP339A1:家蚕B. mori,NP_001121192;BmCYP315A1:家蚕B. mori,NP_001106224;Sl_CYP315A1:斜纹夜蛾 S. litura,XP_022838098;BmCYP333:家蚕B. mori,NP_001266419;BmCYP49A2:家蚕B. mori,NP_001266419;BmCYP314A1:家蚕B. mori,NP_001106219;Sl_CYP314A1:斜纹夜蛾 S. litura,XP_022834006;BmCYP302A1:家蚕B. mori,NP_001036953;Sl_CYP302A1:斜纹夜蛾 S. litura,XP_022816743;BmCYP301A1:家蚕B. mori,XP_021208861;BmCYP49A1:家蚕B. mori,XP_037873587;BmCYP333A2:家蚕B. mori,XP_004932126;BmCYP333B1:家蚕B. mori,XP_004927968;BmCYP333B2:家蚕B. mori,XP_004928105.MtCYP:线粒体CYP Mitochondrial CYP.

2.2 CYP450基因在变态发育过程中的表达

6龄幼虫期主要是CYP306A1和CYP18A1高表达，其中前者主要在中肠中表达，而后者主要在脂肪体中具有最高的表达水平(图2:A)。预蛹期主要是CYP314A1和CYP18A1高表达，这两个基因具有最高表达量的组织分别为脂肪体和中肠(图2:C)。在蛹期，CYP306A1,CYP302A1,CYP314A1和CYP18A1具有相对较高的表达量，其中，CYP306A1仍然在中肠组织中的表达量最高，CYP302A1在表皮中的表达量最高，CYP314A1在中肠和脂肪体中表达量显著高于表皮中的(P<0.05)，而CYP18A1的最高表达峰出现在表皮和中肠(图2:E)。

分组织来看，在蛹期表皮中的CYP18A1具有最高的表达量，显著高于其他组织中的(P<0.05) (图2:B)；在幼虫期中肠中的CYP306A1具有最高的表达量，显著高于其他组织中的(P<0.05)(图2:D)；CYP314A1在预蛹期的脂肪体中和CYP18A1在幼虫期的脂肪体中表达量最高，显著高于其他组织中的(P<0.05) (图2:F)。

总体来看，CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1的表达量相对较高，并且它们分别在幼虫、预蛹和蛹期具有最高的表达量(图2:A,C,E)。在3个典型的变态发育的组织(表皮、中肠和脂肪体)中，主要是CYP306A1,CYP302A1,CYP314A1和CYP18A1具有较高的表达，CYP302A1只在表皮组织中有较高的表达量，而CYP307A1和CYP315A1的表达量在3个组织中的表达量都非常低(图2:B,D,F)。

2.3 喂食不同寄主植物叶片对斜纹夜蛾幼虫发育及CYP450基因表达的影响

在鉴定的CYP450基因表达分析中我们发现CYP306A1在幼虫中肠组织具有最高的表达量(图2:A和D)。为此，我们进一步探究了取食不同寄主植物叶片对幼虫发育的影响以及对CYP306A1在中肠中的诱导表达情况。我们发现，与喂食人工饲料的对照相比，喂食番薯叶和花生叶显著延长了4龄幼虫发育至蛹的历期(P<0.05) (图3:A)。与此同时，喂食这两种寄主植物叶片显著上调了CYP306A1在5龄幼虫中肠中的表达量(P<0.05)(图3:B)。

图2 斜纹夜蛾蜕皮激素合成通路相关的CYP450基因在6龄幼虫(A)、预蛹(C)和蛹(E)期及其表皮(B)、中肠(D)和脂肪体(F)中的表达量Fig.2 Expression levels of the CYP450 genes involved in the edysone synthesis pathway at the 6th instar larval (A),prepupal (C) and pupal (E) stages and in their cuticle (B),midgut (D),and fat body (F)6L:6龄幼虫6th instar larva;PP:预蛹Prepupa;P:蛹Pupa.图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示差异显著(P<0.05,LSD)。图3同。Data in the figure are mean±SE.Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05,LSD).The same for Fig.3.

图3 喂食斜纹夜蛾4龄幼虫不同寄主植物叶片对4龄幼虫发育至蛹的历期(A)和5龄幼虫中肠中CYP306A1表达量的影响Fig.3 Effects of feeding the 4th instar larvae of Spodoptera litura with leaves of different host plants on the developmlental duration from the 4th instar larva to pupa (A) and the expression level of CYP306A1 in the midgut of the 5th instar larvae

2.4 靶向CYP450基因的miRNA

结果表明，有很多miRNA参与调控CYP307A1,CYP315A1,CYP314A1和CYP18A1，其中靶向CYP307A1的miRNA有7种：miR-1175-5p,miR-2-3p,miR-276-3p,miR-305-5p,miR-316-5p,miR-988-3p和miR-iab-3p；靶向CYP315A1的miRNA有3种：miR-13-5p,miR-31-3p和miR-981-3p；靶向CYP314A1的miRNA有1种：miR-9a-5p；靶向CYP18A1的miRNA有8种：miR-2765-5p,miR-305-3p,miR-307-3p,miR-308-3p,miR-31-5p,miR-3286-5p,miR-34-5p和miR-932-3p(表2)。这些结果显示蜕皮激素合成代谢通路受到miRNA广泛而严密的调控。

3 讨论

2017年我们参与组装了斜纹夜蛾基因组，从中注释了138个CYP450基因，并将这些CYP450基因划分为4个亚家族：CYP3,CYP4,CYP2和线粒体CYP(Chengetal.,2017)。CYP3和CYP4基因的分化非常复杂，通常具有物种特异性的基因扩增现象。然而，CYP2和线粒体CYP亚家族却相对比较保守，在大多数物种中都存在直系同源基因(Feyereisen,2012;Chengetal.,2017)。这也意味着CYP2和线粒体CYP的功能在不同物种可能具有高度的相似性。根据直系同源基因比对，本研究从斜纹夜蛾基因组中鉴定出了6个已知的参与蜕皮激素合成代谢的CYP450基因，它们归属于CYP2和线粒体CYP两个亚家族(图1)。研究表明，CYP2亚家族的很多成员，如CYP306A1,CYP307A1和CYP18等都参与昆虫激素的代谢(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)。线粒体CYP亚家族在进化上也起源于CYP2亚家族，但功能上出现了一定的分化，一部分成员，包括CYP302,CYP314和CYP315参与蜕皮激素的代谢，另一部分如果蝇和按蚊Anopheles的CYP12则参与植物次生代谢产物的解毒代谢(Feyereisen,2006)。

表2 靶向斜纹夜蛾蜕皮激素合成通路相关CYP450基因的miRNA预测Table 2 Predication of miRNAs targeting the CYP450 genes involved in the ecdysone synthesis pathway of Spodoptera litura

CYP450基因在昆虫蜕皮激素合成代谢过程中的功能已经被揭示清楚，CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1,CYP315A1和CYP314A1参与蜕皮激素的合成(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)，其中CYP314A1负责将蜕皮激素转变为活性更高的20E，而CYP18A1负责降解20E(Guittardetal.,2011)。然而，在变态发育过程中哪些CYP450基因发挥着关键的调控作用呢？我们发现，在这6个CYP450基因中，只有CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1具有相对较高的表达量，并且在幼虫期CYP306A1的表达量最高，在预蛹期CYP314A1的表达量最高，而CYP18A1在蛹期的表达量最高(图2)。以往有研究表明，这3个CYP450基因都是昆虫变态发育所必需的，在果蝇中突变CYP306A1会导致胚胎发育畸形(Niwaetal.,2004)，在柑桔大实蝇Bactroceraminax中利用RNAi抑制CYP314A1的表达能够显著增加幼虫的死亡率并导致蛹发育畸形(Zhouetal.,2022)，在果蝇中利用RNAi抑制CYP18A1的表达会导致蛹死亡(Guittardetal.,2011)。在鳞翅目昆虫中蜕皮激素的滴度在预蛹期达到最高，在蛹期又急剧降低(Riddiford,1994)，蜕皮激素滴度的这种动态变化与CYP314A1和CYP18A1的表达情况相一致。这显然是由于预蛹期CYP314A1的高表达使得蜕皮激素在该时期的合成量达到最高峰，而蛹期CYP18A1的高表达导致蜕皮激素被大量分解掉。在植物甾醇转化为蜕皮激素的过程中，主要是由CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1和CYP315A1负责(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)。然而，本研究中这些基因中只有CYP306A1在不同变态发育的组织中都具有很高的表达量，CYP302A1仅在表皮中有一定的表达，CYP307A1和CYP315A1在这些组织中几乎不表达(图2)，这意味着，在植物甾醇转化为蜕皮激素的合成过程中，主要是幼虫期高表达的CYP306A1在发挥着关键的作用。综合这些结果可以得出，在蜕皮激素合成代谢过程中，在幼虫期、预蛹期和蛹期发挥关键作用的分别为CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1。

我们经常会观察到取食不同寄主植物后，昆虫的发育速率明显不同。这通常与植物中所含有的某些次生代谢产物对昆虫具有一定的毒害作用有关。CYP450基因家族中，CYP3和CYP4基因亚家族成员通常参与昆虫体内的解毒代谢。然而，也有少量的研究表明参与蜕皮激素合成代谢通路的基因也能够对有毒物质的诱导产生反应。例如，杀虫剂辛硫磷处理后，斜纹夜蛾CYP302A1,CYP306A1和CYP314A1的表达量显著上调(Lietal.,2015;Chengetal.,2017)。在抗啶虫脒的棉蚜Aphisgossypii中，CYP302A1,CYP314A1,CYP306A1和CYP307A1的表达量显著高于在敏感品系中的(Ulahetal.,2020)。我们发现，喂食番薯和花生叶片的斜纹夜蛾幼虫发育历期显著慢于喂食其他两种寄主植物(黄瓜和辣椒)叶片的(图3:A)；并且，取食番薯和花生叶片的5龄幼虫中肠组织中CYP306A1的表达量显著高于喂食另外两种寄主植物叶片的(图3:B)。这意味着，番薯和花生叶片中可能存在着对幼虫生长发育有毒害效应的次生代谢物质，并可以诱导中肠中的CYP306A1产生解毒作用。这些研究结果表明，参与蜕皮激素合成代谢的某些CYP450基因很可能也同时参对植物次生代谢产物的解毒代谢。

越来越多的研究表明，miRNA参与了多种昆虫生理过程的调控。例如，蜕皮激素信号传导通路基因，如蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和E74(ecdysone-induced 74)基因等的表达受到miRNA的严格调控(Luoetal.,2020)。我们采用不同的miRNA预测软件，鉴定出了多个miRNA能够靶向蜕皮激素合成通路的CYP450基因(表2)。有研究表明，在小菜蛾细胞系中添加miR-14b-5p能够显著抑制CYP307A的转录水平(Etebarietal.,2018)。这些结果意味着蜕皮激素合成通路很可能也受到miRNA的调控。这些发现不仅有助于深入理解昆虫变态发育调控的复杂机制，还为将来的害虫防治提供了潜在的作用靶标，有利于斜纹夜蛾等害虫的可持续治理。