预电针心俞穴对急性心肌缺血大鼠心肌保护作用的研究

董亚琴 万隆 黄倩茹 萨喆燕 许金森

摘要：目的 探讨预电针心俞穴对急性心肌缺血大鼠心肌保护作用的可能机制。方法 选用雄性清洁级SD大鼠18只，随机分成生理盐水对照组、急性心肌缺血组、预电针心俞穴组。急性心肌缺血组、预电针心俞穴组用背部皮下多点位注射盐酸异丙肾上腺素（ISO）制备急性心肌缺血大鼠模型，预电针心俞穴组在造模前電针双侧心俞穴3 d。采用苏木精-伊红染色法（HE染色法）观察大鼠心肌组织病理学变化;q PCR检测心肌组织SP mRNA 和CGRP mRNA表达。结果 与急性心肌缺血组相比，预电针心俞穴组可改善大鼠心肌组织病理学变化，抑制心肌组织SP mRNA 和CGRP mRNA的表达，心肌缺血损伤程度减轻。结论 预电针心俞穴对大鼠急性心肌缺血损伤具有一定的保护作用，可能通过调节SP及CGRP表达对心肌缺血损伤起到保护作用。

关键词：预电针;心俞穴;急性心肌缺血;SP;CGRP

中图分类号：R246   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）01-0072-04

Study on the Myocardial Protective Effect of Pre-electroacupuncture at Xinshu Pointson Acute Myocardial Ischemia Rats

DONG Ya-qin， WAN Long， HUANG Qian-ru， SA Zhe-yan， XU Jin-sen

（Fujian Academy of Chinese Medical Science， Fuzhou 350003， China）

【Abstract】Objective： To explore the possible mechanism of pre-electroacupuncture at Xinshu points on myocardial protection in rats with acute myocardial ischemia. Methods： 18 male clean SD rats were randomly divided into normal saline control group， acute myocardial ischemia group， and pre-electroacupuncture at Xinshu acupoint group.  The acute myocardial ischemia group and the pre-electroacupuncture at Xinshu acupoint group was prepared by subcutaneous injection of isoproterenol hydrochloride （ISO） at multiple points in the back to make rat models of acute myocardial ischemia. The Xinshu acupoint group was given electroacupuncture at Xinshu points on both sides for 3 days before modeling. Hematoxylin-eosin staining method （HE staining method） was used to observe the pathological changes of rat myocardial tissue and q PCR was used to detect the expression of SP mRNA and CGRP mRNA in myocardial tissue. Results： Compared with the acute myocardial ischemia group， the pre-electroacupuncture at Xinshu acupoint group can improve the pathological changes of rat myocardial tissue， inhibit the expression of SP mRNA and CGRP mRNA in myocardial tissue， and reduce the degree of myocardial ischemia injury. Conclusion： The pre-electro-acupuncture at Xinshu points has a certain protective effect on acute myocardial ischemia injury in rats， and may play a protective effect on myocardial ischemia injury by regulating the expression of SP and CGRP.

【Key words】Pre-Electroacupuncture; Xinshu Acupoint; Acute Myocardial Ischemia; SP; CGRP

冠心病是心血管疾病死亡的重要原因，又称缺血性心脏病[1]。它严重威胁着人们的生命健康。针灸在预防和治疗缺血性心脏病的研究中得到了肯定。早在2002 年，世界卫生组织在《针灸临床研究报告的回顾与分析》中肯定了冠心病是推荐针灸治疗病种之一。

急性心肌缺血可以激活心肌的伤害性感受器，引起伤害性神经信号向中枢神经系统传导，同时心肌组织内的感觉神经末梢受刺激引起P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）等神经肽的释放，导致神经源性炎症反应，加重心肌损伤[2-4]。研究表明，心俞穴针刺预防冠心病心肌缺血在临床中应用比较广范，有研究发现心俞穴预处理对心肌缺血可以发挥一定的心肌保护作用[5]。但其客观作用机理，目前仍不明确。本研究拟观察预电针心俞穴对急性心肌缺血大鼠血清SOD浓度、心肌组织SP和CGRP表达的影响，旨在探讨其减轻心肌缺血损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠18只，清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，体重250±20g。实验前7d适应性饲养于福建省中医药科学院实验动物中心，饲养条件：温度（22±2）℃，濕度（55±15）%，12h明暗交替，自由进食与饮水。随机分为生理盐水对照组、急性心肌缺血组和预电针心俞穴组，每组6只。

1.1.2 主要试剂 异丙肾上腺素（ISO）（美国Sigma公司）;HE染液套装（北京索莱宝科技有限公司，货号G1003）;SYBR premix ExTaq TM（日本TakaRa公司）;Trizol Reagent（美国invitrogen 公司）;PrimeScript 逆转录试剂盒（日本TakaRa公司），引物由日本TakaRa公司合成。

1.1.3 主要仪器 Powerlab多导数据采集分析系统（澳大利亚埃德公司）;小动物麻醉呼吸系统（深圳瑞沃德生命科技有限公司）;SDZ-Ⅱ型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）;JB-P5型石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司），LEICA RM2016切片机;7500 Fast Real-Time PCR System（美国 Applied Biosystems 公司），梯度荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems 公司），ALLEGRA 64R型台式高速冷冻离心机（美国Beckman公司），微量加样枪（德国Eppendorf公司），NanoDrop 2000 分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作[6] 按每日60 mg /kg的剂量（40mg/mL 溶于生理盐水中）于背部皮下多部位注射异丙肾上腺素，连续注射2 d，间隔24 h。生理盐水对照组：于背部皮下多部位注射与急性心肌缺血组等量的生理盐水，连续注射2 d，间隔24 h。心肌缺血大鼠模型制模成功的心电图出现S-T段下移，异常Q波。

1.2.2 干预措施 预电针心俞穴组的取穴方法参照《实验针灸学》动物标准穴位图谱[7]。心俞穴：背部，第5胸椎棘突下旁开约1.5 cm处。选双侧心俞穴，选用0.25 mm×13 mm 华佗牌无菌毫针，直刺0.1cm，连接SDZ-Ⅱ电针仪，电压1～2 V，以针体轻微抖动为度，断续波，频率2/10Hz，每次20min，每天1次。第1次注射ISO前3 d开始治疗，连续3d。急性心肌缺血组和生理盐水对照组给予同等条件抓取，不做任何治疗。

1.2.3 病理学切片检测 切取大鼠左心室，常规固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片，行HE染色，光镜下观察心肌细胞病理改变[8]。

1.2.4 RNA的提取和质量检测 实验结束后，大鼠腹腔注射10% 的水合氯醛麻醉后断颈处死，立即取出心脏组织，用PBS冲洗，迅速放入RNA保存液，-4℃冰箱保存。取新鲜冻存心脏组织，将左心室剪成所需大小组织，用Trizol一步法提取细胞中的总RNA，NanoDrop 2000 分光光度计测检测RNA纯度和浓度。1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。NanoDrop 2000分光光度计测定RNA在260 nm和280 nm波长的吸光度值，评估RNA量和质量。

1.2.5 实时荧光定量PCR 每个样本分别取2μg总RNA进行逆转录，所得cDNA于-80℃保存。引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系：SYBR premix ExTaq TM 10μL，primer-F：0.4μL，primer-R：0.4μL，ROX II：0.4μL，ddH2O 6.8μL，cDNA 2μL，20μL 体系。反应条件：（1）预变性 95℃ 30 s。（2） 变性：95℃5 s。（3）退火，延伸，60℃ 30 s，40个循环。采用 ABI 7500 Real time PCR仪检测各样本中mRNA的表达情况。实验采用ΔΔCt 法。见表1。

1.2.6 统计学方法 用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，定量数据采用（x±s）表示。针刺前后比较采用配对t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理学变化 由图1可以看出生理盐水对照组大鼠心肌细胞结构完整，排列整齐，无明显炎性细胞浸润。急性心肌缺血组心肌组织中可见较多心肌纤维轻度水肿，胞质疏松淡染（黑色箭头），周围间质可见水肿，结缔组织排列疏松（红色箭头），伴有少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润（蓝色箭头）。预电针心俞穴组心肌组织中可见少量心肌纤维轻度水肿，胞质疏松淡染（黑色箭头），细胞间隙略有增宽，伴有少量淋巴细胞与中性粒细胞点状浸润（蓝色箭头）。与急性心肌缺血组相比，预电针心俞穴组改善了大鼠心肌组织病理学变化，心肌缺血损伤程度减轻。

2.2 各组大鼠心肌组织SP mRNA和CGRP mRNA表达 由表2可见，急性心肌缺血组心肌组织SP mRNA和CGRP mRNA表达较生理盐水对照组明显升高，有显著性意义（P<0.05）;预电针心俞穴可以使两者都有所下降，但SP mRNA无显著性差异。

3 讨论

心俞穴是手少阴心经的背俞穴，在心肌缺血治疗中占有重要地位。据穴位解剖资料，心俞穴其下有第4、5对胸神经分支通过，心脏疾病常在此处出现牵扯痛、敏感点或“阳性反应物”，刺激该处可调整心脏功能，宽胸宁心安神。大量临床和实验研究表明，电针心俞穴可显著改善急性心肌缺血心功能，对缺血性心脏病的心肌细胞亦有保护作用[9-11]。

HE染色切片可以形象直观地观察组织形态学改变。急性心肌缺血组出现较多心肌纤维轻度水肿，结缔组织排列疏松等，反映了注射ISO后，大鼠心肌组织在形态学方面会出现不同程度的病理改变。预电针心俞穴改善了心肌组织的病理改变，提示预电针心俞穴可改善大鼠心肌组织形态学结构，对心肌具有保护作用。

本实验结果显示，与生理盐水对照相比，急性心肌缺血组心肌组织SP mRNA和CGRP mRNA水平显著升高，表明急性心肌缺血确实能够诱发强烈的心肌局部和全身炎症反应，提示神经源性炎症机制可能参与心肌缺血的病理学过程。预电针心俞穴组大鼠心肌组织SP mRNA和CGRPmRNA水平均较急性心肌缺血组都有下降，CGRP mRNA有显著性差异，提示电针心俞穴预处理可能通过激活脊髓背角α2-肾上腺素能受体，抑制周围Aδ和C类传入纤维的疼痛冲动，从而抑制伤害性神经元放电，抑制伤害性神经递质SP和CGRP等炎症介质释放[12-13]，从而有效地减轻心肌缺血损伤。

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（收稿日期：2021-04-12）