新风胶囊对佐剂关节炎大鼠滑膜M1/M2巨噬细胞极化的影响

赵磊 万磊 刘健 黄传兵 马熙檬 朱子衡

摘要：目的 观察新风胶囊对佐剂关节炎（AA）大鼠滑膜M1/M2巨噬细胞极化的影响。方法 将大鼠随机均分为正常（NC）组、模型（MC）组和新风胶囊（XFC）组，每组10只，除正常组外，MC组和XFC组构建成AA大鼠模型。致炎后第12 d开始给药，给药30 d后，检测各组大鼠关节炎指数（AI），电镜观察滑膜超微结构，ELISA检测血清细胞因子的表达，流式细胞术检测大鼠外周血炎症极化标志物CD86+细胞、CD206+细胞的表达。结果 与NC组相比，MC组大鼠AI、IL-1、CD86+细胞的表达升高，IL-10、CD206+细胞的表达降低差异均具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与MC组大鼠相比，XFC组大鼠AI、IL-1、CD86+细胞的表达降低，IL-10、CD206+细胞的表达升高差异均具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论 新风胶囊可能通过调节M1/M2巨噬细胞极化改善佐剂关节炎大鼠关节炎症。

关键词：佐剂关节炎;巨噬細胞极化;新风胶囊

中图分类号：R285.5   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）01-0062-05

Effect of Xinfeng Capsule on Polarization of Synovial M1/M2 Macrophagesin Rats with Adjuvant Arthritis

ZHAO Lei1， WAN Lei2， LIU Jian1， HUANG Chuan-bing1， MA Xi-meng1， ZHU Zi-heng1

（1. Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China;2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Anhui 230031， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of Xinfeng Capsule on the polarization of synovial M1/M2 macrophages in adjuvant arthritis （AA） rats. Methods： The rats were randomly divided into normal （NC） group， model （MC） group and Xinfeng Capsule （XFC） group， 10 rats per group. Except for the normal group， the MC group and XFC group were made into AA rat models. The administration was started on the 12th day after the inflammation， and 30th day after the administration， and the arthritis index （AI） of each group was measured. The ultrastructure of the synovial membrane was observed under electron microscope， the expression of serum cytokines was measured by ELISA， and the expression of CD86+ cells and CD206+ cells in the peripheral blood of the rats was measured by flow cytometrym， which are markers of inflammatory polarization. Results： Compared with that of the NC group， the expression of AI， IL-1 and CD86+ cells of the MC group increased， and the expression of IL-10 and CD206+ cells decreased， and the difference was statistically significant （P<0.05， P<0.01） and compared with that of the MC group， the expression of AI， IL-1， and CD86+ cells of the XFC group decreased， and the differences of the increased expression of IL-10 and CD206+ cells were statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Conclusion： Xinfeng Capsule may improve the joint inflammation of adjuvant arthritis rats by regulating the polarization of M1/M2 macrophages.

【Key words】Adjuvant Arthritis; Macrophage Polarization; Xinfeng Capsule

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常见的慢性风湿性炎症性疾病，估计在成年人群中的患病率为 0.24%-1.25%，其特征是明显的滑膜增生和关节滑膜炎，这是炎症细胞因子显着过量产生引起的骨和软骨破坏的结果。未经治疗，RA 可能导致严重的进行性关节破坏[1-2]。M1 巨噬细胞表面标志物为CD80+细胞，参与炎症的诱导和恶化，并表达包括IL-1在内的促炎细胞因子。另一方面，M2 巨噬细胞表面标志物为CD206+细胞，通过产生IL-10在内的抗炎细胞因子的表达来参与抗炎反应[3]。IL-1是炎症区域的有效细胞因子，在调节先天免疫和适应性免疫之间的交互方面很重要，并在炎症反应的激活和调节等机制中发挥核心作用，通过激活破骨细胞导致骨侵蚀，从而造成骨破坏，加速RA的进展[4-5]。IL-10 被称为免疫调节细胞因子，IL-10可促进M2型巨噬细胞的极化，同时极化的M2型巨噬细胞会分泌更多的 IL-10，促进血管生成、组织重塑和修复，减轻炎症反应[6]。研究发现[7-8]，新风胶囊（XFC）能调控炎性细胞因子，通过下调IL-1、上调IL-10的表达，明显改善RA患者临床症状，也能降低佐剂关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠免疫炎症反应，调节炎症极化状态，从而抑制免疫、炎症反应，抑制软骨破坏，达到治疗RA的作用。本文通过研究新风胶囊对AA大鼠关节炎指数、滑膜超微结构、滑膜M1/M2巨噬细胞分泌因子（IL-1、IL-10）及滑膜M1/M2巨噬细胞表面标志物的影响，探讨新风胶囊调节佐剂关节炎大鼠滑膜M1/M2巨噬细胞极化的的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级SD雄性大鼠30只，体质量（190±20）g。由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：Lscxk（皖）2017-001。动物伦理编号：AHUCM-rats-2021022。

1.1.2 药物与试剂 新风胶囊（安徽中医药大学第一附属医院制剂中心，批号：191015）;IL-1、IL-10试剂盒（武汉基因美公司，货号分别为JYM0419Ra、JYM0651Ra）;CD86-PE、CD206-AF647试剂（美国santa cruz生物技术公司，货号分别为SC-19617、SC-20060）。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模及给药 按照随机对照表将将30只大鼠随机分为正常（NC）組、模型（MC）组和新风胶囊（XFC）组，每组10只。除NC组外，MC组和XFC组大鼠构建成佐剂关节炎大鼠模型[9]。致炎后第12 d开始给药，XFC组（0.034 g/mL）：大鼠按1 mL/100 g灌胃，1次/d;NC组及MC组：生理盐水1mL/100 g灌胃，1次/d。各组连续用药30 d。

1.2.2 大鼠关节炎指数的测定 在造模后1 d、给药后30 d测量各组大鼠关节炎指数[10]。

1.2.3 电镜观察大鼠滑膜超微结构 大鼠滑膜组织固定、脱水、包埋，组织进行超薄切片，透射电镜观察摄片。

1.2.4 ELISA法检测大鼠血清细胞因子IL-1、IL-10的表达 腹主动脉采血，离心取上清液，操作步骤依照ELISA试剂盒说明。

1.2.5 流式细胞术检测大鼠外周血炎症极化标志物CD86+细胞、CD206+细胞的表达 大鼠新鲜血液100μL，按每106个细胞/管分别加入抗鼠M1型巨噬细胞标志物（CD86-PE）、M2型巨噬细胞标志物（CD206-AF647）（0.25μg）/抗鼠。按照说明书操作，上EPICS型流式细胞仪检测。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件分析，实验数据以（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新风胶囊对AA大鼠关节炎指数的影响 与NC组相比，MC组AA大鼠Al表达显著升高;与MC组比较，XFC组Al表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01，表 1）。

2.2 新风胶囊对AA大鼠滑膜超微结构影响 电镜下NC组滑膜细胞线粒体无变形、肿胀，粗面内质网丰富，核膜边界清楚，染色质分布均匀，嵴突排列规整;MC组滑膜细胞呈变形、肿胀，线粒体肿胀肥大并破坏，粗面内质网减少、破坏，核膜不完整，边界不清，染色质分布不均，嵴突排列不规整、部分消失;XFC组滑膜细胞线粒体少量呈变形、肿胀，粗面内质网较多，核膜边界较清楚，染色质较均匀，大部分嵴突排列完整（图1）。

2.3 新风胶囊对AA大鼠滑膜M1/M2巨噬细胞分泌因子（IL-1、IL-10）的影响 与NC组相比，MC组细胞因子IL-1表达升高，IL-10表达降低;与MC组比较，XFC组IL-1表达降低，IL-10 表达升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01，表2）。

2.4 新风胶囊对AA大鼠滑膜M1/M2巨噬细胞表面标志物影响 与NC组相比，MC组AA大鼠M1表面标志物CD86+细胞表达升高，CD206+细胞表达降低;与MC组比较，XFC组CD86+细胞表达降低，CD206+细胞表达升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01，表3，图2，图2）。

3 讨论

RA是一种自身免疫性炎症性关节疾病，巨噬细胞在RA的滑膜中聚集，巨噬细胞可在不同因素的诱导下由M1型和M2型之间相互转换，这就是巨噬细胞极化现象。在RA的发生发展过程中，M1和M2型巨噬细胞之间的动态平衡被打破，M1型促炎巨噬细胞的比例高于M2型抗炎巨噬细胞，造成比例失衡，导致IL-1等炎症细胞因子的分泌和炎症反应的加剧，加速机体炎症反应，造成局部和全身性骨丢失，最终导致关节侵蚀和破坏[11-13]。

在炎症反应的早期阶段，在应对微生物挑战以及各种炎症因子的刺激下，巨噬细胞能极化形成M1巨噬细胞，M1巨噬细胞可分泌大量促炎性细胞因子（如IL-1），滑膜细胞和软骨细胞中的 IL-1信号传导导致降解软骨的基质金属蛋白酶的上调和分泌，此外，当存在T细胞衍生的核因子-κB受体活化因子配体时，IL-1会发挥促破骨细胞作用，激活成纤维细胞和破骨细胞，加速机体炎症反应，导致骨侵蚀，造成关节破坏和进一步的关节损伤[14-15]。调节性T细胞、调节性B细胞是具有抗炎和抗凋亡特性的特殊细胞，这些细胞可以通过多种机制减少炎症引起的组织损伤并创造适当的免疫微环境，同时通过IL-10影响巨噬细胞极化来发挥其免疫调节作用[16]。IL-10是一种关键的抗炎细胞因子，由活化的免疫细胞产生，IL-10诱导的M2型巨噬细胞具有减轻炎症、吞噬功能、产生细胞外基质成分、血管生成和趋化因子产生的作用，同时能调节CD4+、CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等免疫细胞的活性，可以起到抗炎作用[17]。IL-10 可通过抑制破骨细胞生成来维持骨骼健康，在 IL-10 缺陷小鼠中进一步强调了IL-10的重要性，其中观察到骨质疏松症的所有标志，即骨量减少、机械脆性增强和骨形成减少[18]。

中药新风胶囊（黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤组成）具有健脾益气、化湿通络功效，应用于临床疗效确切[19-20]。本研究发现，经新风胶囊治疗后，AA大鼠关节炎指数得到显著改善，炎性细胞因子IL-1水平及CD80+细胞显著降低，抗炎细胞因子IL-10水平及CD206+细胞表达显著升高，说明新风胶囊可能通过调节M1/M2巨噬细胞极化进而下调IL-1、上调IL-10水平的表达，从而改善佐剂关节炎大鼠关节炎症。

综上所述，新风胶囊可能通过调节M1/M2巨噬细胞极化改善佐剂关节炎大鼠关节炎症。

参考文献：

[1]Ziade N，Arayssi T，Elzorkany B，et al.Development of an Educational Video for Self-Assessment of Patients with RA：Steps，Challenges，and Responses[J].Mediterr J Rheumatol，2021，32（1）：66-73.

[2]Zhu J，Wang J，Huang J，et al.MicroRNA-140-5p regulates the proliferation，apoptosis and inflammation of RA FLSs by repressing STAT3[J].Exp Ther Med，2021，21（2）：171.

[3]Kaneko J，Okinaga T，Hikiji H，et al.Zoledronic acid exacerbates inflammation through M1 macrophage polarization[J].Inflamm Regen，2018（38）：16.

[4]Peng YJ，Peng CT，Lin YH，et al.αDecoy Receptor 3 Promotes Preosteoclast Cell Death via Reactive Oxygen Species-Induced Fas Ligand Expression and the IL-1/IL-1 Receptor Antagonist Pathway[J].Mediators Inflamm，2020（2020）：72-81.

[5]Italiani P，Mosca E，Della Camera G，et al.Profiling the Course of Resolving vs.Persistent Inflammation in Human Monocytes：The Role of IL-1 Family Molecules[J].Front Immunol，2020（11）：1426.

[6]Su BX，Han HB，Gong YQ et al.Let-7d inhibits intratumoral macrophage M2 polarization and subsequent tumor angiogenesis by targeting IL-13 and IL-10[J].Cancer Immunol Immunother，2021（70）：1619-1634.

[7]Wan L，Liu J，Huang CB，et al.Xinfeng capsule for the treatment of rheumatoid arthritis patients with decreased pulmonary function-a randomized controlled clinical trial[J].Chin J Integr Med，2016，22（3）：168-176.

[8]万磊，刘健，黄传兵，等.基于CD19～+B细胞调控FAK/CAPN/PI3K通路研究新风胶囊改善类风湿关节炎机制[J].中国中药杂志，2021，46（14）：3705-3711.

[9]姜辉，刘晓闯，秦秀娟，等.五味温通除痹胶囊促进佐剂性关节炎大鼠滑膜组织细胞自噬活性及机制[J].细胞与分子免疫学杂志，2017，33（5）：586-590，596.

[10]万磊，刘健，黄传兵，等.雷公藤甲素对佐剂关节炎肺功能降低大鼠Notch通路受体和配体基因表达的影响[J].南方医科大学学报，2015，35（10）：1390-1394.

[11]Degboé Y，Rauwel B，Baron M，et al.Polarization of Rheumatoid Macrophages by TNF Targeting Through an IL-10/STAT3 Mechanism[J].Front Immunol，2019（10）：3.

[12]Luo XL，Cui JC，Long X，et al.TLRs Play Crucial Roles in Regulating RA Synoviocyte[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2020（20）：1156-1165.

[13]Liu S，Song LP，Li RB，et al.Iguratimod promotes transformation of mononuclear macrophages in elderly patients with rheumatoid arthritis by nuclear factor-κB pathway[J].World J Clin Cases，2021，9（10）：2181-2191.

[14]Pyrillou K，Burzynski LC，Clarke MCH.Alternative Pathways of IL-1 Activation，and Its Role in Health and Disease.[J].Front Immunol，2020（11）：63-70.

[15]Han CY，Yang Y，Sheng YJ，et al.The mechanism of lncRNA-CRNDE in regulating tumour-associated macrophage M2 polarization and promoting tumour angiogenesis[J].J Cell Mol Med，2021，25（9）：4235-4247.

[16]Xie K，Chai YS，Lin SH，et al.Luteolin Regulates the Differentiation of Regulatory T Cells and Activates IL-10-Dependent Macrophage Polarization against Acute Lung Injury[J].J Immunol Res，2021（2021）：39-43.

[17]Sapra L，Bhardwaj A，Mishra PK，et al.Regulatory B Cells（Bregs）Inhibit Osteoclastogenesis and Play a Potential Role in Ameliorating Ovariectomy-Induced Bone Loss[J].Front Immunol，2021（12）：69-72.

[18]Kim YK，Kim SE，Chang Park H，et al.Human recombinant IL-10 reduces xenogenic cytotoxicity via macrophage M2 polarization[J].Biochem Biophys Rep，2020，24：75-80.

[19]文建庭，劉健，王馨，等.新风胶囊含药血清对TNF-α诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡和炎症的影响[J].中国中药杂志，2021，46（2）：436-443.

[20]鲍丙溪，刘健，万磊，等.新风胶囊通过miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR抑制骨关节炎CD4～+T与软骨细胞共培养的免疫炎症[J].南方医科大学学报，2021，41（4）：483-494.

（收稿日期：2021-10-29）