CD44在结肠癌组织及结肠癌细胞中的表达意义

孔琼琼 邓涛

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率逐年上升[1]。结肠癌早期症状不明显，通常确诊时已属中晚期，导致患者错过最佳治疗时机[2-3]。因此深入探究结肠癌发病机制，寻找可提示预后及早期预警的分子标志物具有重要意义。CD44是常见的肿瘤标志物，在肿瘤转移中发挥重要作用，是近期研究较多的肿瘤标志物[4-7]。本研究比较并分析了结肠癌组织和结肠癌细胞中CD44的表达情况，探讨CD44的表达意义，以期为临床诊断和治疗结肠癌提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 CD44单克隆抗体购自中国迈新公司，结肠癌细胞系HT29和正常结肠上皮细胞系NSM460购自美国ATCC细胞库，异硫氰酸酯（fluoresceine isothiocyanate,FITC）染色试剂盒和RIPA细胞裂解液购自上海恒斐生物科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 病例资料 收集浙江省舟山医院2021年1—12月经手术切除的56例结肠癌患者结肠癌组织及同一患者的癌旁组织。56例患者中男36例，女20例；年龄47～87（61.52±8.89）岁；Dukes分期A～B期24例，C～D期32例；组织分化程度低分化15例，中、高分化41例；淋巴结转移27例。纳入标准：经病理检查证实为结肠癌；均为首次诊断，未采取化疗或放疗等相关治疗；具有完整的临床资料。排除标准：合并其他恶性肿瘤；临床资料缺失。

1.3 方法

1.3.1 结肠癌组织和癌旁组织细胞CD44阳性率检测 采用二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）法。取石蜡包埋的癌组织及癌旁组织标本，常规切片，脱蜡，脱水，抗原修复，山羊血清室温封闭40 min，加入CD44一抗，4℃孵育过夜；加入二抗后室温孵育，DAB显色，苏木精复染1 min。脱水、透明、封片后显微镜下检查。由病理医师读取结果，以细胞膜棕黄色或棕褐色着色者为阳性，每张切片选取5个高倍视野计数。依据Rahman等[6]标准，染色细胞数占所有细胞数＜5%为阴性，≥5%为阳性。

1.3.2 HT29和NSM460中CD44阳性率检测 采用FITC染色法。HT29及NSM460均培养于含10%FBS RPMI 1640培养基中，采用0.02%胰酶消化传代，取对数生长期细胞制备单细胞悬液，调整细胞数至1×107/ml，灭活兔血清封闭，加入CD44单抗1 μg，PBS溶液洗涤2次，每次5 min，滴加FITC标记二抗。FITC可与蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合并显示出黄绿色。依据染色细胞数量判断CD44阳性率，每组重复3次取平均值。

1.3.3 HT29和NSM460中CD44蛋白表达的测定 采用Western blot法。分别收集对数生长期的HT29和NSM460，加入RIPA细胞裂解液冰浴裂解30 min，提取细胞总蛋白；以3 000 r/min离心6 min，收集上清液，采用BCA法测定总蛋白含量。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用3%FBS白蛋白封闭1 h后，加入CD44一抗，4℃过夜；使用含Tween 20的Tris缓冲盐水漂洗，加入二抗，常温孵育1 h，漂洗，加入增强型化学发光试剂（efficient chemiluminescence kit,ECL）工作液，显色，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为内参，应用凝胶图像处理系统分析条带灰度值。

1.4 观察指标 （1）比较结肠癌组织和癌旁组织细胞CD44阳性率；（2）比较不同病理特征结肠癌患者癌组织细胞CD44阳性率；（3）比较两组细胞中CD44阳性率；（4）比较两组细胞中CD44蛋白表达水平。

1.5 统计学处理 使用SPSS 26.0统计软件。计量资料用±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用例数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织和癌旁组织细胞CD44阳性率比较结肠癌组织细胞CD44阳性37例（66.07%），癌旁组织8例（14.28%），差异有统计学意义（χ2=31.241，P＜0.05）。

2.2 不同病理特征结肠癌患者癌组织细胞CD44阳性率比较 不同性别、年龄和肿瘤直径癌组织中细胞CD44阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；C～D期癌组织中细胞CD44阳性率高于A～B期，低分化癌组织中细胞CD44阳性率高于中、高分化癌组织，淋巴结转移患者癌组织中细胞CD44阳性率高于无淋巴结转移患者癌组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 不同病理特征结肠癌患者癌组织中细胞CD44阳性率比较

2.3 两组细胞CD44阳性率比较 FITC染色结果显示，HT29细胞CD44阳性率（82.34%±6.56%）高于NSM460（23.14%±4.61%），差异有统计学意义（t=12.789，P＜0.05）。

2.4 两组细胞CD44蛋白表达水平比较 Western blot结果显示，HT29中CD44蛋白灰度值高于NSM460，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 HT29和NSM460中CD44蛋白表达的比较（a：蛋白电泳图；b：蛋白灰度值）

3 讨论

结肠癌发病原因复杂，通常认为是遗传因素与生活环境因素共同作用的结果[8-10]。结肠癌发病率和病死率高，严重威胁人们生命安全。因此，临床上采取科学有效的诊治结肠癌方法具有重要意义。

研究发现，肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展的内在因素，在肿瘤转移及复发中发挥重要作用[11-12]。CD44基因是恶性肿瘤标志物，位于人类11号染色体短臂上，长度约50 kb，编码的CD44蛋白分子量为85～200 kDa。作为细胞黏附分子，CD44蛋白可介导淋巴细胞向炎症部位和黏膜相关组织的归位、黏附细胞外基质及淋巴细胞的归巢等[13-17]。探索CD44在消化系统恶性肿瘤中作用的相关信号通路，对今后治疗设计具有重要意义。目前，关于CD44具体作用结果仍存在较多争议。刘振峰等[18]研究表明，非小细胞肺癌组织中CD44蛋白表达阳性率高于肺部良性病变者。王莹等[19]研究显示，小细胞肺癌患者血清和肿瘤组织中可检测到CD44的表达，体能状态（physical strength,PS）2分的患者肿瘤组织中CD44阳性率（85.71%）高于PS 0～1分患者（30.00%），疾病进展患者血清CD44浓度明显高于疾病控制患者，肿瘤组织CD44阳性表达高于疾病控制患者，及肿瘤组织CD44阳性患者无进展生存期短于CD44阴性患者。由此可见，CD44可作为恶性肿瘤治疗的靶点。本研究显示，结肠癌组织CD44蛋白阳性率高于癌旁组织，提示CD44蛋白在结肠癌组织中明显高表达；C-D期患者癌组织CD44蛋白阳性率高于A-B期，低分化患者癌组织CD44蛋白阳性率高于中、高分化，淋巴结转移患者癌组织CD44蛋白阳性率高于无淋巴结转移患者的癌组织，提示CD44蛋白表达与与Dukes分期、组织分化程度和淋巴结转移密切相关；结肠癌细胞中CD44蛋白阳性率和CD44蛋白灰度值均高于正常结肠上皮细胞系，提示CD44蛋白在结肠癌细胞中明显高表达。

综上所述，CD44在结肠癌组织及结肠癌细胞中均高表达。