马尾藻复合菌发酵液的制备及其对橡胶苗抗寒性的影响

2022-02-03袁佳娜刘海林林清火茶正早郭澎涛黄艳艳杨红竹罗微

南方农业学报 2022年10期

袁佳娜，刘海林，林清火，茶正早，郭澎涛，黄艳艳，杨红竹，罗微*

（1海南大学，海南海口 570228；2中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/中国热带农业科学院土壤肥料研究中心，海南海口 571101）

0 引言

【研究意义】海藻提取是以天然海藻为原材料，利用某种手段使海藻内部的细胞遭到破碎，将内部的营养物质释放出来，海藻提取液富含海藻多糖、氨基酸及矿物质等植物生长调节物质和微量元素（冯敬涛，2019），是一种环保、高效纯天然的新型生物肥料。褐藻是全球范围内应用最为广泛的海藻提取物的生产原料，主要包括海带、马尾藻、泡叶藻、巨藻等（丛大鹏和咸洪泉，2009；Yoruklu et al.，2021）。我国海藻资源丰富，采用合适的提取工艺，将这些功能物质提取出来，可广泛运用到实际生产中，其开发和应用前景十分广阔。在低温胁迫、干旱胁迫或盐胁迫等逆境条件下，施用海藻提取物可增强植物抗逆性（Rayirath et al.，2009；Shukla and Kumar，2018）。天然橡胶是重要的战略资源和工业原料，主要来源于橡胶树。橡胶树是一个典型的热带雨林树种，性喜高温多雨之地，适宜生长温度为23~32℃，海南作为我国天然橡胶种植的主要区域之一，地处热带地区北缘，属于非传统植胶区，低温是橡胶树遭受到最严重的自然灾害之一，激烈的降温和持续的低温会对橡胶树生理机能造成伤害，使橡胶树生长受阻、植株部枯萎，甚至大面积死亡，严重影响了橡胶产业的可持续发展（陈小敏等，2020）。因此，加强对橡胶树抗寒性相关研究，对橡胶产业的稳定发展具有重要意义。【前人研究进展】当前海藻类发酵液的提取工艺的主要方式有物理方法、化学方法和微生物方法等。物理方法主要包括超声波破碎法、冷冻粉碎法和研磨法等。采用物理方法取得的海藻提取物外源污染物较少，但该方法不易大规模操作且成本较高。化学方法即利用化学试剂处理海藻，具有成本较低、操作简单的优点，但制得的海藻提取物活性较低，且有机溶剂会对环境造成污染（耿银银等，2017；Parreidt et al.，2018）。利用生物降解得到的海藻提取物的方法具有简单便捷、可操作性强、绿色环保等特点，日益受到人们的重视（刘培京，2012）。王强等（2005）在水分胁迫下研究海藻液肥对黄瓜植株生长的影响，试验结果表明海藻液肥可提高黄瓜体内酶活，降低干旱对黄瓜的伤害。陈迪文等（2021）研究表明喷施海藻提取物可增加植物株高和干物质量，缓解干旱胁迫对甘蔗造成的伤害。杨春妹等（2021）采用海藻酸裂解酶酶解和微泡菌菌解得到海带降解物，研究降解产物对菜心非生物胁迫抗性的影响，发现喷施海藻提取液可提高菜心的株高、生物量、SPAD和叶片含水量，缓解逆境对菜心的损伤。周丽等（2021）利用活性菌种对海藻进行发酵分解，使海藻中有效成分释放，以所制得的海藻提取液为基液，添加腐殖酸和尿素等元素制成海藻复合肥，试验结果是海藻复合肥显著提高了黄瓜的株高和茎粗。【本研究切入点】当前关于马尾藻降解菌的研究主要集中在单一菌种上，多个菌种组成的复合菌剂协同发酵的研究鲜有报道，同时关于低温施用外源物质提高橡胶树抗寒性的研究甚少。【拟解决的关键问题】研究芽孢杆菌、里氏木霉和黑曲3种复合菌剂对马尾藻发酵产物理化特征的影响，以期获得马尾藻发酵的最优菌剂组合，同时研究最优组合发酵液对橡胶幼苗抗寒性的影响，为海藻液肥的制备及其在橡胶树上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2021年5—7月在海南省儋州市中国热带农业科学院橡胶研究所土壤肥料研究室（北纬19°11′~19°52′，东经108°56′~109°46′）进行马尾藻发酵试验及低温胁迫试验。马尾藻粉购自荣成市崖头润玉贸易行，发酵菌种枯草芽孢杆菌购自北海群林生物工程有限公司，黑曲霉和里氏木霉购自上海保藏生物技术中心。纯品海藻酸购自正能量农业发展股份有限公司。供试品种热研7-33-97橡胶幼苗由海南天然橡胶新型种植材料创新基地提供，选用84株株高20 cm左右、健康状况良好、长势一致的植株。

主要仪器设备：人工气候箱（PGX-10008宁波海署赛福）、桌上式洁净工作台（VD-850型苏州净化）、立式压力蒸汽灭菌器（BKQ-B50II山东博科消毒设备有限公司）、万分之一电子天平（XP204型青岛精诚仪器仪表有限公司）、紫外可见分光光度计（PE Lambda 25海南紫洋科技有限公司）、上海力辰邦西仪器科技有限公司HH-4型电热恒温水浴箱（HH-4型上海力辰邦西仪器科技有限公司）、离心机（LD5-2型南京嘉美伦科学仪器有限公司）、超低温冰箱（U101-85美国NBS公司）、全温培养摇床（ZD-88常州菲普实验仪器厂）等。

1.2 试验设计

1.2.1 马尾藻复合菌发酵复合菌发酵试验采用单因素试验，设置3组不同发酵试验处理，即添加芽孢杆菌、复合菌剂1（里氏木霉∶芽孢杆菌=1∶1）、复合菌剂2（里氏木霉∶芽孢杆菌∶黑曲霉=1∶1∶1）。根据前期试验结果，采用每个处理马尾藻发酵液500 g，马尾藻发酵液初始pH为7.5，芽孢杆菌接种量为6%，料液比1∶30，每处理3个重复。在将装有500 g发酵液的发酵瓶中加入菌剂后放入摇床中，设置转速为180 r/min，摇床温度为30℃，发酵周期为5 d。在发酵0、12、24、36、48、60、72、84、96、108和120 h取发酵液进行测定。

1.2.2 低温胁迫试验.试验前期称取所需马尾藻粉末，将马尾藻粉末封口后在高压灭菌3 h，排除其他杂菌的干扰。将马尾藻与无菌水按1∶0混合均匀，调节pH为7.5，添加复合菌剂1，接种量均为6%，在30℃、180 r/min条件下的摇床中菌解24 h，即为马尾藻发酵液。如表1所示，设置7个不同胁迫程度处理，设置常规处理（RT）与添加海藻类外源物质处理（SF和CT）对比，探究低温条件（15℃）下添加海藻类外源物质对橡胶幼苗抗逆性的影响，同时在低温条件下添加前期试验所制得马尾藻发酵液处理（SF），与市面上购买的纯品海藻肥处理（CT）比较，探究所制得马尾藻发酵液的抗逆性效果。每处理3次重复，每个重复4株橡胶苗，共84株。将橡胶幼苗移植在装有1 L Hoagland溶液的黑色塑料桶中。缓苗1个星期，按浓度加入海藻发酵液后放入智能人工气候箱RXM-358B中。人工气候箱设置光照强度均为5000 lx，光周期为12 h/12 h（昼/夜），相对湿度85%。试验期间每隔3 h用通气泵通气5 min，每3 d更换1次营养液。处理时间为7 d。

表1 低温胁迫处理试验设计Table 1 Experiment design of low temperature stress treatment

1.3 指标测定与方法

采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定发酵液中还原糖和总糖的含量，按照以下公式计算多糖提取率：

海藻酸采用咔唑硫酸分光光度法测定，pH的测定采用玻璃电极法，植物根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量，可溶性蛋白（Soluble protein，SP）采用考马斯亮蓝G-250法测定，紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT），过氧化物酶（POD）采用愈创木酚法测定，超氧化物歧化酶（SOD）采用氮蓝四唑光化还原法测定，生物量为鲜重。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2016进行分析处理，采用SPSS 26.0的Duncan’s法进行差异显著性分析，采用Origin 2018制图。

2 结果与分析

2.1 复合菌剂对马尾藻发酵液pH的影响

由图1可知，发酵过程中芽孢杆菌、复合菌剂1和复合菌剂2处理的发酵液pH变化趋势一致，均表现为先下降后上升。在12 h之内pH由初始值7.50急剧下降，各处理达最低值，其中，芽孢杆菌处理下降幅度较小，下降12.8%，12 h时的pH为6.54；复合菌剂1处理的发酵液pH下降至6.32，下降16.0%，降幅最大；复合菌剂2处理发酵液pH降至6.60，降幅（11.9%）最小。12 h之后随着发酵时间的延长，各处理的发酵液pH呈缓慢上升趋势，其中，在72~84 h芽孢杆菌处理发酵液pH呈下降趋势；3个处理的发酵液pH在96~20 h没有明显变化，稳定在7.50~8.00。由此可知，不同菌剂对发酵液pH影响较小。

图1 不同菌剂对马尾藻发酵液pH的影响Fig.1 Effects of different microbial agents on pH of Sargassum fermentation broth

2.2 复合菌剂对马尾藻发酵液海藻酸含量的影响

由图2可知，在发酵前期（0~36 h）复合菌剂处理的马尾藻发酵液中海藻酸含量变化较小，均在24 h时达最大值（0.18%），此时2个处理间海藻酸含量无显著性差异（P＞0.05，下同）；在48 h时观察到发酵液中2个处理海藻酸含量均显著降至最低值（P＜0.05，下同），复合菌剂1处理降至初始值的64%，下降幅度较大，复合菌剂2处理降低47%；48 h之后又呈上升趋势，上升幅度较小。芽孢杆菌处理在发酵前期海藻酸含量较低，至24 h时与其他处理差异显著；36 h时海藻酸含量达最大值（0.16%）；72 h时下降至最低值，比36 h时下降60%，海藻酸含量仅0.05%，此时与复合菌剂处理差异显著。在72 h后3个处理的海藻酸含量稳定在0.05%~0.10%，表明微生物对马尾藻的降解作用主要集中在36 h之内。

图2 不同菌剂对马尾藻发酵液海藻酸含量的影响Fig.2 Effects of different microbial agents on alginic acid content in Sargassum fermentation broth

2.3 复合菌剂对马尾藻发酵液多糖提取率的影响

由图3可知，芽孢杆菌在发酵120 h之内多糖提取率均显著低于复合菌剂处理。芽孢杆菌处理在36 h时多糖提取率达最高值，为4.7%，但仍低于复合菌剂处理的最低值。不同复合菌剂对马尾藻多糖提取率的影响较大，其中，发酵12 h时复合菌处理间差异显著；24 h时2个处理的多糖提取率均达最大值，复合菌剂1处理的多糖提取率达14.08%，显著大于复合菌剂2处理；24 h之后多糖提取率开始下降，36 h时下降幅度为41%~50%，多糖提取率在7.5%左右，处理间无显著差异；60 h时2个复合菌剂处理的多糖提取率均达最低值；此后，随着发酵时间的延长，虽然多糖提取率有所上升，但仍显著低于24 h时的多糖提取率水平。由此可见，与单一菌剂相比，不同微生物协同可显著提高多糖提取率。复合菌剂对马尾藻的发酵效果显著优于单一菌剂，同时添加2种复合菌剂处理对马尾藻降解效果显著优于添加3种复合菌剂。根据试验结果，复合菌剂1对马尾藻功能物质提取效果最优，且添加2种菌剂效果经济效益更高，故选择复合菌剂1（里氏木霉∶芽孢杆菌）进行后续低温胁迫试验。

图3 不同菌剂对马尾藻发酵液多糖提取率的影响Fig.3 Effects of different microbial agents on polysaccharide extraction rate of Sargassum fermentation broth

2.4 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗生物量的影响

由图4可知，与RT处理对比，受低温胁迫影响的橡胶幼苗生物量有所下降。RT处理生物量最高，为1.83 g/株。低温处理中，SF3处理的生物量最高，为1.77 g/株，SF4处理的生物量最低，为0.18 g/株；SF4与RT处理生物量差异显著，其余处理则与RT处理无显著性差异。其中原因可能是所选幼苗较小且低温胁迫时间较短，对幼苗生物量影响较小。

图4 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗生物量的影响Fig.4 Effects of different concentrations of Sargassum fermentation broth on biomass of rubber seedlings

2.5 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗根系活力的影响

根系作为植物吸收和运输养分的重要器官，对植物的生长发育起着重要的作用。从图5可知，在低温处理条件下，橡胶幼苗的根系活力均有所下降，其中，CK和SF4处理根系活力处于较低水平，分别为0.027和0.030 mg/（g·h），根系受到的伤害最大，与RT和SF3处理差异显著。RT和SF3处理的根系活力较高，分别为0.056和0.051 mg/（g·h）。除SF4处理和CK之外，施用马尾藻发酵液的橡胶幼苗根系活力与RT处理间无显著性差异。因此，低温条件橡胶幼苗根系受到显著的影响，将马尾藻发酵液稀释200~600倍可缓解低温对植物根系造成的伤害。

图5 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗根系活力的影响Fig.5 Effects of different concentrations of Sargassum fermentation broth on root activity of rubber seedlings

2.6 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗MDA和SP含量的影响

MDA是细胞膜脂过氧化的最终产物，其含量常被作为细胞膜损伤程度的生理指标。SP是重要的渗透调节物，其含量的增加是植物在逆境条件下维持细胞正常渗透势的重要手段。由图6可知，RT处理的橡胶苗体内MDA含量为0.024 μmol/L，显著低于低温胁迫的各处理；CK的橡胶苗MDA含量最高，为0.033 μmol/L。在施用马尾藻发酵液的处理中，SF3处理的橡胶幼苗MDA含量最低，为0.029 μmol/L，显著低于CK、SF1和SF4处理。表明马尾藻发酵液与市面上购买的海藻肥均可有效减少橡胶幼苗MDA的生成。RT处理的橡胶幼苗SP含量最低，为57.85 mg/g；与RT处理相比，经低温胁迫处理的橡胶幼苗SP含量有所提高，其中CK的橡胶苗SP含量为62.97 mg/g，增幅（8%）最小，两者间无显著性差异。在施用海藻类外源物质的处理中，SF3和CT处理的橡胶幼苗SP含量则显著高于RT处理，其中SF3处理的SP含量最高，为80.85 mg/g，比RT处理提高22%；其余处理虽然SP含量高于RT处理，差异未达显著。综上所述，施用马尾藻发酵液对橡胶幼苗的MDA和SP含量影响较为显著，将其稀释600倍可更好地保护植物。

图6 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗MDA和SP含量的影响Fig.6 Effects of different concentrations of Sargassum fermentation broth on MDA content and SP content in rubber seedlings

2.7 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗抗氧化酶活性的影响

SOD、CAT和POD是植物细胞保护酶系统，其活性直接关系到植物在低温胁迫下抵御伤害的能力。由图7可知，与RT处理相比，经过低温胁迫的橡胶幼苗，除SF1外其余处理的POD活性均有所下降，但处理间无显著性差异；SF1处理的POD活性显著增加，为331.66 U/g，比RT处理增加56.2%。3种抗氧化酶中SOD活性最高的，其中SF3处理的SOD活性最高，为753.53 U/g，SF1、SF2、SF3和CT处理比RT处理的SOD活性显著增加3.3%~4.2%。CAT活性变化明显，SF2处理的CAT活性最高，比RT处理提高2.9倍，为324.86 U/g，SF1和SF3处理次之，上述3个处理的CAT活性显著高于其他处理。因此，低温环境下施用一定量的马尾藻发酵液可提高低温胁迫下橡胶幼苗SOD和CAT活性。

图7 不同浓度马尾藻发酵液对橡胶幼苗抗氧化酶活性的影响Fig.7 Effects of different concentrations of Sargassum fermentation broth on antioxidant enzyme activity of rubber seedlings

3 讨论

3.1 降解工艺对马尾藻降解产物中活性物质的影响

芽孢杆菌具有耐高温、快速复活和较强分泌酶等特点，其生活环境多样，能产蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等10多种酶（惠明等，2008）。同时具有较高的海藻多糖降解活力，能综合性提高海藻中各项活性成分的种类及含量（白新峰，2021）。单一菌种发酵存在代谢产物大量积累会反馈阻遏相关酶类合成的问题，而混合菌种协同能有效地解决这一问题（张玉鹏等，2021）。本研究结果显示，比起单一菌种，复合菌剂可显著提高对马尾藻的多糖提取率，其中里氏木霉与芽孢杆菌协同发酵效果显著优于黑曲霉、里氏木霉和芽孢杆菌三者协同发酵效果。黑曲霉和里氏木霉在发酵过程中均可产生丰富的纤维素酶和木聚糖酶，降解细胞壁中纤维素。相关研究表明，里氏木霉与黑曲霉在协同产纤维素酶时，黑曲霉的延迟接种优于二者同时接种，黑曲霉产β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶的能力较强，但产外切葡聚糖酶的能力较弱，致使纤维素酶的总体酶活不高，同时弱酸环境更适合黑曲霉产酶（张聪聪，2020），这可能是导致本研究中3种菌剂发酵效果次于2种菌剂发酵的原因。

本研究以芽孢杆菌、里氏木霉和黑曲霉作为提取马尾藻功能性物质的菌剂，发现芽孢杆菌和里氏木霉对马尾藻降解效果最优，在24 h提取率到达14.08%。在前人研究中，其他海藻类物质的多糖提取率在4.9%~12.1%（张楠，2020；孙菁雯，2021），马尾藻多糖提取率为5.98%~7.06%（王芹建，2020）。本研究多糖提取率高于前人研究结果，推测是由于所选试剂更适用提取马尾藻多糖，且设置温度适于菌群生长，故提取率较高。已有的研究发现利用枯草芽孢杆菌和黑曲霉对海带的最优发酵时间在48~120 h（王明鹏，2017），而本研究中所需发酵时间较长，推测由于微生物菌剂在发酵过程中，需要一定时间产生纤维素酶并降解马尾藻粉细胞壁，马尾藻粉与海带相比更易被微生物降解，因此导致本研究最优提取时间与前人研究有所差异。

3.2 低温胁迫条件下马尾藻降解产物对橡胶幼苗抗寒性的影响

海藻降解产物能显著促进植物生长、提高作物的抗逆性。海藻提取物最标志性活性物质即为海藻酸，海藻酸是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古罗糖醛酸（G）组成的高分子多糖，一般以一价盐或二价盐的形式存在。具有改良土壤，提高肥、药、水利用率，激发土壤活力，以及诱导植物抗逆性的功效（桑卫民等，2020）。同时海藻多糖具有清除活性氧的作用，可有效减少过多自由基细胞造成的损害。相关研究表明添加海藻类外源物质能有效提高作物的抗逆性，在低温环境下，施用海藻降解产物能够提高蔬菜根系活力，提高植物叶片SP含量，减少体内MDA含量，增强植株的抗逆性（王强和石伟勇，2003；王强等，2005；尹媛红，2018），本研究也得出相同结果，说明添加一定量的马尾藻发酵液可保护植物的根系，在逆境胁迫下，植物体内MDA含量减少，推测是由于添加海藻类外源物质处理可缓解植物体内产生大量的活性氧化物导致膜透性的损伤，降低MDA含量。添加海藻类外源物质能增加橡胶幼苗体内SP含量，有利于降低植物体内渗透势，增强其抗逆性。海藻发酵液中的某些物质在一定浓度下才发挥促进植物生长的作用，过高或过低浓度反而起抑制作用（何锐等，2020）。本研究结果显示，随着马尾藻发酵液浓度的增加，对低温条件下橡胶幼苗生长的提升作用呈先增加后降低的趋势，以稀释600倍的效果最明显，说明该浓度是试验条件下最适合使用的浓度。

在遭受低温胁迫时，植物会产生一系列生理紊乱，植物细胞内各种抗氧化酶存在一个动态平衡，当其中一个抗氧化酶发生变化时，其他酶活也会受影响。不同的抗氧化酶彼此协同，调节作物抗氧化系统（王旭承等，2022）。本研究发现在低温条件下添加马尾藻发酵液橡胶幼苗体内SOD和CAT活性增加，而POD活性降低。已有研究发现在逆境情况下橡胶幼苗体内SOD和POD活性降低，显著提高CAT活性（吴敏，2011）；而施用海藻提取物，均能显著提高SOD、POD和CAT活性（刘旋等，2018；Shukla and Kumar，2018）；随着时间的延长，植物POD和CAT活性呈先升后降的趋势（秦文斌等，2019）。本研究结果与前人研究相似，在低温条件下POD活性呈下降趋势，而SOD和CAT活性增加，表明低温胁迫时产生的活性氧主要还是依靠3种保护酶的相互协调来平衡清除，使作物细胞维持在正常动态水平，减少逆境伤害。