氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺氨代谢相关指标及细胞凋亡的影响

2022-02-03黄勇戴习林

南方农业学报 2022年10期

黄勇，戴习林*

（1水产科学国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306；2农业农村部淡水水产种质资源重点实验室（上海海洋大学），上海 201306）

0 引言

【研究意义】自20世纪90年代以来，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）产业迅速发展，已成为我国最重要的水产养殖动物之一（滕瑜等，2021）。凡纳滨对虾对环境的适应性强，具备广温广盐的生理特性，加上养殖技术的进步，养殖范围已扩展到内陆低盐地区。氨氮来自含氮有机物的分解，以NH4+和NH3的形态存在，NH3毒性较强；在集约化养殖过程中，受温度、pH、水交换条件等的限制，水体氨氮浓度难以稳定在较低水平，使甲壳类受到氨氮胁迫，导致组织损伤，免疫力下降，影响甲壳类的生长发育和存活（Koo et al.，2005；Miranda-Filho et al.，2009；黄姝，2017）。因此，研究氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾的影响有助于凡纳滨对虾产业的健康发展。【前人研究进展】氨氮胁迫会扰乱甲壳类的机体代谢，降低免疫力，对组织造成损伤，使其更易被病原所侵袭（葛红星等，2014）。熊大林等（2020）研究表明，经15 mg/L氨氮胁迫72 h后，凡纳滨对虾鳃组织边界模糊，鳃丝松散，细胞分解，鳃组织损伤导致生理功能紊乱。方金龙等（2017）在无胁迫和15.6 mg/L氨氮胁迫下，分别对凡纳滨对虾注射白斑综合征病毒（WSSV）粒子，通过荧光定量PCR检测白斑综合征病毒VP28基因表达量，结果显示72 h后氨氮胁迫组显著高于无胁迫组，导致WSSV增殖更快的原因在于氨氮胁迫会降低凡纳滨对虾的免疫酶活性。彭军辉等（2018）研究指出，在氨氮浓度范围0~140 mg/L对拟穴青蟹（Scylla paramamosain）进行急性毒性胁迫试验，24和48 h时，死亡率随氨氮浓度增加而升高；且血清中溶菌酶（LZM）活力在各实验组中受到抑制，对病原的抵抗能力降低。当甲壳类受到环境中的病原或有毒物质的攻击时，机体会开启先天性免疫防御，产生大量的活性氧以抵抗病原入侵，但过量活性氧同样会损害机体自身（于杰伦，2019）。董学兴等（2019）研究表明，罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）幼虾在0~1.06 mg/L非离子氨胁迫48 h后，体内丙二醛（MDA）含量随氨氮浓度增加而上升，反映出机体内产生过多的活性氧，活性氧对细胞的攻击程度与氨氮浓度成正相关。活性氧含量过高还会刺激凡纳滨对虾细胞凋亡基因显著表达，促进细胞凋亡发生（李玲等，2021）。王芸等（2017）研究表明，中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）在8 mg/L氨氮胁迫下，血淋巴总抗氧化能力在6 h后呈降低趋势，机体抗氧化平衡被破坏，导致细胞凋亡基因Caspase显著上调。细胞色素C（CytC）能激活细胞凋亡途径，最终激活凋亡效应因子Caspase-3，诱导细胞凋亡发生（Hegazi et al.，2010）。为应对氨氮胁迫，甲壳类依赖氨代谢途径将氨氮排出体外或将氨氮代谢为尿素和谷氨酰胺等低毒、中性物质（Ip et al.，2004；周发林等，2016）。【本研究切入点】甲壳类肝胰腺功能主要是消化、吸收和储存营养物质，对甲壳类的生长发育、抵抗病菌病毒感染和环境不利因素提供能量有重要作用，也是免疫和氨氮解毒代谢的重要器官（王小刚，2015；杨晨，2020）。在养殖中后期，养殖水体有机物大量累积，底部水体氨氮含量大幅增加，长期氨氮胁迫会对凡纳滨对虾肝胰腺造成不利影响，导致生长缓慢。前人研究氨氮对凡纳滨对虾的影响在氨代谢方面多为急性毒性试验，缺少慢性氨氮胁迫和细胞凋亡相关试验。【拟解决的关键问题】通过20和40 d氨氮慢性胁迫，比较凡纳滨对虾的生长存活、酶活性、基因表达量和TUNEL检测结果，研究养殖中后期氨氮对凡纳滨对虾肝胰腺的影响，为凡纳滨对虾免疫机理研究和生产实践指导提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用凡纳滨对虾取自上海申漕特种水产开发有限公司，使用曝气自来水和海水晶调盐度调至3，水温为30~31℃，溶解氧为5 mg/L，pH为8.0~8.1，暂养于水泥池中，2周后进行正式试验。

1.2 试验方法

通过预试验得知，凡纳滨对虾氨氮胁迫96 h-LC50约60.0 mg/L，取该浓度的20%（12.0 mg/L）为最高浓度组。设4个氨氮浓度：0（对照组）、0.9、5.2和12.0 mg/L，对应非离子氨浓度为0、0.08、0.49和1.13 mg/L。将480尾初始体质量6.49±0.14 g的凡纳滨对虾分为4个组，6个平行。其中3个平行用于20 d采样，另外3个平行用于40 d采样。试验在75.5 cm×55.0 cm×45.5 cm的养殖箱中进行，水体体积100 L，每日定时（6：00、14：00、22：00）、定量（每餐投喂量占虾体质量1.5%）投喂，摄食1.5 h后，清出含氮废物，参考王华等（2013）的方法确定和调整氨氮浓度，每天换水97%，使用Na2CO3溶液维持pH稳定，用NH4Cl配制成10 g/L母液，稀释成所需浓度。于慢性氨氮胁迫20和40 d时采样，样品采集前一天停止投喂，各浓度组随机选取3尾凡纳滨对虾，采集血淋巴保存于抗凝管中。将凡纳滨对虾肝胰腺组织剖出，用预冷PBS清洗再吸干后，放入离心管中，于-80℃冰箱中保存。同时取肝胰腺组织用组织固定液（波恩氏液）保存，用于制作石蜡切片和细胞凋亡染色。

1.3 生长指标和存活率测定

体质量增长率（WGR）和存活率（SR）分别按如下公式计算：

WGR（%）=（WT-W0）/W0×100

式中，WT为终末体质量，W0为初始体质量，T为时间（20和40 d）。

SR（%）=（N0-NT）/N0×100

式中，N0为初始数量，NT为试验结束时的数量。

1.4 生理生化指标测定

采用血氨、尿素氮、谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测血淋巴和肝胰腺生理生化指标。

1.5 基因表达量测定

采用TRIzol法提取肝胰腺RNA，天根生化科技（北京）有限公司反转录试剂盒进行反转录。在GenBank中查询凡纳滨对虾Cyt C（KX096890.1）、Caspase-3（EU421939.1）和β-actin（JF288784.1），使用Primer Premier 5.0设计引物，50.0 µL体系进行PCR扩增，将琼脂糖凝胶有特异性条带的PCR产物送测验证［生工生物工程（上海）股份有限公司］，得到特异性引物（表1）。完成实时荧光定量PCR检测后，采用2-△△Ct法计算基因相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR扩增引物序列Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR amplification primer sequences

1.6 TUNEL检测

根据上海碧云天生物技术有限公司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法）说明书，对凡纳滨对虾肝胰腺组织进行石蜡包埋、切片、生物素标记及样品显色后封片观察。

1.7 统计分析

试验数据采用SPSS 25.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 氨氮慢性胁迫下凡纳滨对虾生长存活的变化

由表2可知，氨氮胁迫20和40 d，0.9、5.2和12.0 mg/L组凡纳滨对虾体质量增长率和存活率均显著低于对照组（P＜0.05，下同），且体质量增长率和存活率均呈随氨氮浓度增加而降低的变化趋势。

表2 氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾生长存活的影响Table 2 Effects of chronic ammonia nitrogen stress on growth and survival of L.vannamei

2.2 氨氮慢性胁迫下凡纳滨对虾氨代谢的变化

2.2.1 血淋巴氨氮和尿素氮含量变化.由图1可知，氨氮胁迫20 d，各氨氮浓度组血淋巴氨氮含量分别为177.75、253.27、435.15和886.99 μmol/L，氨氮胁迫40 d，各氨氮浓度组血淋巴氨氮含量分别为145.80、317.88、649.73和1265.30 μmol/L。血淋巴氨氮和尿素氮含量均呈随氨氮浓度增加而升高的变化趋势，且各胁迫组显著高于对照组。其中，在氨氮胁迫20 d，5.2 mg/L组与12.0 mg/L组的血淋巴尿素氮含量无显著差异（P＞0.05，下同），而氨氮含量差异显著。氨氮胁迫40 d时0.9~12.0 mg/L组血淋巴氨氮含量比20 d高，氨氮胁迫20 d后血淋巴氨氮含量在体内积累，而尿素氮含量在2个时间点变化不明显。

图1 氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾血淋巴的影响Fig.1 Effects of chronic ammonia nitrogen stress on hemolymph of L.vannamei

2.2.2 肝胰腺GDH和GS活性变化.由图2可知，氨氮胁迫20 d，GDH和GS活性随氨氮浓度增加整体呈升高趋势，0.9、5.2和12.0 mg/L组显著高于对照组，5.2 mg/L组与12.0 mg/L组的GDH活性无显著差异。氨氮胁迫40 d，GDH和GS活性随氨氮浓度增加呈先升高后降低的变化趋势；0.9和5.2 mg/L组的GDH活性显著高于对照组，12.0 mg/L组显著低于对照组；0.9 mg/L组的GS活性显著高于对照组，5.2和12.0 mg/L组均显著低于对照组。说明氨氮胁迫40 d，当氨氮浓度超过5.2 mg/L，机体合成谷氨酸和谷氨酰胺的能力受到抑制，去除氨氮的能力降低。

图2 氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺GDH和GS活性的影响Fig.2 Effects of chronic ammonia nitrogen stress on GDH activity and GS activity in hepatopancreas of L.vannamei

2.3 氨氮慢性胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性的变化

由图3可知，氨氮胁迫20 d，T-SOD活性随氨氮浓度增加呈先升高后降低的变化趋势，0.9和5.2 mg/L组显著高于对照组，12.0 mg/L组显著低于对照组；氨氮胁迫40 d，0.9 mg/L组显著高于对照组，5.2和12.0 mg/L组显著低于对照组。而氨氮胁迫20 d，CAT活性随氨氮浓度增加整体呈升高趋势，各胁迫组显著高于对照组，其中5.2 mg/L组与12.0 mg/L组无显著差异；氨氮胁迫40 d，0.9 mg/L组的CAT活性显著高于对照组，5.2和12.0 mg/L组显著低于对照组。说明氨氮胁迫40 d，当氨氮浓度超过5.2 mg/L，机体的抗氧化能力受到抑制。

图3 氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的影响Fig.3 Effects of chronic ammonia nitrogen stress on antioxidant activity in hepatopancreas of L.vannamei

2.4 凡纳滨对虾肝胰腺细胞凋亡基因表达量变化

由图4可知，氨氮胁迫20 d，Cyt C基因相对表达量随氨氮浓度增加而升高，各胁迫组显著高于对照组，5.2 mg/L组与12.0 mg/L组无显著差异；氨氮胁迫40 d，Cyt C基因相对表达量随氨氮浓度增加呈先升高后降低的变化趋势，5.2和12.0 mg/L组显著高于对照组。氨氮胁迫20 d，Caspase-3基因相对表达量随氨氮浓度增加而升高，0.9、5.2和12.0 mg/L组显著高于对照组；氨氮胁迫40 d，Caspase-3基因相对表达量随氨氮浓度增加整体呈升高趋势，各胁迫组显著高于对照组，5.2 mg/L组与12.0 mg/L组无显著差异。表明受到氨氮胁迫后，各浓度组机体发生不同程度的细胞凋亡。

图4 氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺Cyt C和Caspase-3基因相对表达量的影响Fig.4 Effects of chronic ammonia nitrogen stress on relative expression level of Cyt C gene and Caspase-3 gene in hepatopancreas of L.vannamei

2.5 凡纳滨对虾肝胰腺TUNEL检测结果

由图5可知，氨氮胁迫20和40 d，对照组凋亡细胞数量极少，肝小管饱满，排列整齐，边界清晰，星状管腔形状完整。随氨氮浓度增加，凋亡细胞数量增加，肝小管变形，排列紊乱，边界模糊，星状管腔变形，氨氮胁迫40 d较20 d细胞凋亡情况更严重。

图5 氨氮慢性胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺TUNEL检测结果Fig.5 TUNEL results of L.vannamei hepatopancreas under chronic ammonia nitrogen stress

3 讨论

经过氨氮胁迫20和40 d后，凡纳滨对虾体质量增长率和存活率随氨氮浓度增加而降低，随时间和氨氮浓度的增加，凡纳滨对虾体质量增长越慢，存活率越低。通过TUNEL检测结果显示，肝胰腺凋亡细胞数量随氨氮浓度增加而增加，且氨氮胁迫40 d凋亡细胞数量较20 d更多。李志辉等（2018）研究表明，脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）养殖密度越高，养殖水体中的氨氮含量越高，特定生长率和存活率受到氨氮胁迫的抑制。王梦杰等（2021）研究表明，氨氮胁迫浓度越高，台湾泥鳅（Paramisgurnusdabryanusssp.Taiwan）幼鱼的增重率和特定生长率越低，且处理组的肝组织细胞核发生偏移、溶解，细胞边界模糊。由此可知，氨氮慢性胁迫后，对凡纳滨对虾生长和存活产生不利影响，与肝胰腺受损密切相关。

在水体中，氨氮以NH4+和NH3形式存在，NH3可直接进入细胞膜，破坏膜结构，影响蛋白质代谢和损伤DNA（Martins Dutra et al.，2016）。为应对氨氮胁迫，甲壳类依赖氨代谢途径将氨氮主动排出体外或代谢为尿素和谷氨酰胺等低毒、中性物质（Ip et al.，2004；周发林等，2016）。Hong等（2007）研究指出，中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）经48 h氨氮胁迫后，血淋巴氨氮含量显著升高。王芸（2011）研究发现，中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）经96 h氨氮胁迫，2、4、6和8 mg/L组血淋巴氨氮和尿素氮含量呈上升趋势，为减少氨氮累积，凡纳滨对虾机体开启氨代谢解毒机制，加速尿素氮生成。本研究结果中，凡纳滨对虾经氨氮胁迫20 d后，各浓度组血淋巴氨氮含量分别为177.75、253.27、435.15和886.99 μmol/L；氨氮胁迫40 d，各浓度组血淋巴氨氮含量分别为145.80、317.88、649.73和1265.30 μmol/L。血淋巴尿素氮含量呈随氨氮浓度增加而升高的趋势，各浓度组血淋巴氨氮含量均高于各组环境的氨氮浓度，且氨氮胁迫40 d血淋巴氨氮含量较20 d多，说明环境氨氮会扩散并积累在血淋巴中。机体随氨氮胁迫时间越长，对血淋巴氨氮清除能力会降低，而尿素氮含量在20和40 d水平相差不明显，反映出机体对氨氮转化为尿素氮水平在20 d达最高水平。血淋巴连接各个组织，氨氮通过血淋巴影响肝胰腺组织代谢。为代谢多余的氨氮，肝胰腺GDH和GS联合发挥作用，将氨和谷氨酸转化为谷氨酰胺，从而达到降低氨氮毒性保护机体代谢的作用（李志辉等，2018）。何玉英等（2016）使用16 mg/L氨氮胁迫中国对虾72 h，肝胰腺GDH基因相对表达量随时间增加而升高，氨代谢途径被诱导发生，加速合成谷氨酰胺以保护机体。邱立国（2017）研究表明，氨氮浓度在3.4~24.6 mg/L，凡纳滨对虾肌肉GDH和GS活性在5~10 d时受到抑制，过高浓度的氨氮超过肌肉代谢范围，导致代谢紊乱。而本研究中，氨氮胁迫20 d后，GDH和GS活性显著高于对照组，氨氮胁迫40 d后，氨氮浓度高于5.2 mg/L时，谷氨酸代谢途径受到抑制，说明长期受氨氮胁迫，机体受到损伤，导致氨代谢途径紊乱，谷氨酰胺合成能力受阻，造成血淋巴氨氮含量大量累积。

据报道，氨氮胁迫会刺激肝胰腺产生过多的活性氧，对抗氧化系统造成影响，为应对氧化应激产生的活性氧损伤，机体可通过抗氧化酶来平衡氧化还原反应，从而起到保护机体的功能正常运转和适应胁迫环境的作用（何玉英等，2016）。T-SOD和CAT联合作用清除活性氧和过氧化氢的抗氧化作用是甲壳类先天性免疫中至关重要的一部分（于杰伦，2019）。王芸（2011）对中国对虾进行96 h氨氮胁迫，肝胰腺CAT活性在0~48 h受氨氮刺激显著升高，在48~96 h活性氧含量过高，CAT活性受到抑制。熊大林等（2020）用15 mg/L浓度氨氮胁迫凡纳滨对虾72 h，胁迫组鳃T-SOD活性显著升高，活性氧含量显著降低。较低浓度的氨氮可刺激抗氧化酶活性上升，而高浓度氨氮会抑制抗氧化酶活（Sun et al.，2014）。本研究结果中，氨氮胁迫20 d，0.9和5.2 mg/L组T-SOD活性显著高于对照组，12.0 mg/L组显著低于对照组；而氨氮胁迫40 d，5.2和12.0 mg/L组T-SOD活性受到抑制；这可能是高浓度或长期氨氮胁迫导致血淋巴氨氮大量积累，对机体造成严重损伤，抑制T-SOD活性。在氨氮胁迫20 d，CAT活性随氨氮浓度的增加而升高；而在氨氮胁迫40 d，5.2和12.0 mg/L组的CAT活性显著低于对照组。说明氨氮浓度高于5.2 mg/L胁迫40 d后，机体内大量活性氧难以被有效清除，对机体造成氧化损伤。

机体抗氧化能力不足以对抗氧化应激时，过多的活性氧会增加细胞凋亡率（邱立国，2017）。CytC能激活Caspase-3，而Caspase-3是线粒体凋亡途径和死亡受体途径中的常见效应子，Caspase-3的激活象征着细胞进入不可逆的凋亡阶段（Jung et al.，2014）。李玲等（2021）用10.5 mg/L镉（Cd）刺激凡纳滨对虾，24 h后凡纳滨对虾体内产生大量的活性氧，Caspase-3基因表达量显著上升。贾旭颖（2014）研究发现凡纳滨对虾受高浓度非离子氨胁迫后，抗氧化酶活性被抑制，产生过量活性氧诱导肝胰腺CytC含量和Caspase-3活性升高。在本研究中，凡纳滨对虾受氨氮胁迫20和40 d后，肝胰腺CytC和Caspase3基因相对表达量均随氨氮浓度增加呈升高趋势。氨氮胁迫会使活性氧在肝胰腺内大量产生，增加CytC的表达量，大量的细胞色素C释放，从而调节Caspase-3表达量升高，诱导细胞凋亡发生，对组织造成损伤，导致凡纳滨对虾氨代谢紊乱，机体对氨氮清除能力下降。