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丁酸钠对染氟小鼠骨矿含量及骨微结构的影响

2022-02-03杨凤梅李洋杰吴利刘杰孙璐张卓

实用医学杂志 2022年24期
关键词:微结构小梁酸钠

杨凤梅 李洋杰 吴利 刘杰 孙璐 张卓

沈阳医学院1公共卫生学院,2基础医学院(沈阳 110034);3辽宁省疾病预防控制中心放射卫生所(沈阳 110015)

氟是人体正常生长发育过程中必不可少的微量元素[1-3]。自然环境中氟化物含量丰富,饮用水是人体氟化物的主要来源。现已证明,在推荐剂量下的氟摄入对机体健康是有益的,对骨骼和牙齿的矿化起着至关重要的作用。然而,过量氟摄入可引起慢性氟中毒,引发骨骼和关节周围组织的一系列特征性变化,并导致患者出现不同程度的运动功能障碍[4-6]。已有实验表明低浓度氟中毒促进成骨细胞增殖,高浓度氟中毒则抑制成骨细胞的增殖[7]。目前,氟中毒的发病机制尚未明确,也缺乏行之有效的防治药物,特别是在氟中毒流行地区,氟摄入过量受累人数众多,这已然引起了学者们的广泛关注。

丁酸钠是丁酸的钠盐形式之一,丁酸现已被证明影响成骨细胞的增殖与分化[8]。研究发现丁酸钠与机体健康密切相关,在调节肠道健康、提高免疫力及抗炎抑癌等方面意义重大[9-11]。丁酸钠抑制牙周膜干细胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs)的成骨细胞分化能力作用已被证实[12]。随着研究深入,学者们发现[13-14],丁酸钠在预防实验性大鼠骨质疏松和刺激人成骨细胞矿化等方面有积极作用。由于目前关于丁酸钠对氟中毒小鼠的拮抗作用尚不清楚。因此,本研究旨在观察丁酸钠对氟中毒小鼠骨代谢及骨显微结构的影响,为进一步探索防治氟中毒性骨病的有效方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物清洁级初断乳雄性ICR小鼠24只,体质量(20±2)g,购自辽宁长生生物科技有限公司,实验动物合格证号:SCXK(辽)2015-0001,饲养于沈阳医学院动物实验中心,温度(24±2)℃,相对湿度(55±5)%,小鼠自由饮水、进食。适应性喂养1周后,进入正式实验。本实验经沈阳医学院动物伦理委员会批准(批号:SYYXY2021031502)。

1.1.2 主要试剂与仪器氟化钠(NaF)(Sigma,美国,纯度% ≥ 99%);丁酸钠(SB)(Macklin,中国,纯度 ≥98.5%),均为白色粉末状;Micro-CT(Sky-Scan1276,Switzerland);YLS-16A 小动物骨强度测定仪(YLS-16A,济南益延);原子吸收仪(AA-7000,日本岛津);氟离子选择电极(PXS-270,上海雷磁)。

1.2 方法

1.2.1 动物处理24只初断乳雄性ICR小鼠,按照体质量均衡的原则随机分为对照组、氟中毒组(100 mg/L NaF)、丁酸钠组(100 mg/L NaF+500 mg/kg丁酸钠)3组,每组8只。对照组小鼠饮用蒸馏水,氟中毒组和丁酸钠组小鼠饮含F-浓度为100 mg/L的蒸馏水,各组均饲普通饲料,持续13周;随后,丁酸钠组每只小鼠按500 mg/kg丁酸钠灌胃,对照组和氟中毒组则以生理盐水灌胃,各组摄食饮水方式与前期保持不变,持续时间7周。动物实验结束后,各组小鼠脱颈处死,取左侧股骨和胫骨,剔除肌肉组织后,用生理盐水湿润的纱布包裹,封袋后-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 Micro-CT将处理好的股骨垂直放置于标本管内,用湿纸巾缠绕固定,Micro-CT扫描后,采集的样本数据集使用配套软件进行分析并三维重构。股骨远骨端骨小梁扫描选择距生长板0.215 mm,厚度为1.72 mm的骨髓腔区域。骨小梁物理参数如下:骨小梁骨密度(trabecular bone mineral density,Tb.BMD),骨体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)能够反映不同样本骨小梁骨量的多少,骨小梁厚度(trabecula thickness,Tb.Th)表示骨小梁平均厚度,骨小梁数目(trabecular number,Tb.N)代表感兴趣区域中,每mm中骨组织与非骨组织交点数量的平均值,骨小梁间隙(trabecular separation,Tb.SP)表示骨小梁之间髓腔平均宽度,Tb.Th、Tb.N、Tb.SP是评价骨小梁空间形态结构的主要指标,骨小梁结构模型指数(structure model index,SMI)描述小梁结构组成结构中板层结构和杆状结构比例的参数,发生骨质疏松时,骨小梁从板状向杆状转变,该值增大。Tb.Th、Tb.N、Tb.SP、SMI数值是由CTAn软件分析得出的值。

1.2.3 骨结构强度实验取胫骨,经室温环境平衡1 h后,将其放入骨骼强度测定仪中进行压碎实验,压碎速率为1.2 mm/s,检测骨组织结构强度。

1.2.4 骨矿物质含量测定股骨烘干、炭化后,转移至550℃马弗炉中,干法消化6 h。消化完全后,骨灰溶解于5%硝酸溶液中备用。原子吸收法测定股骨中钙、镁、锌的含量,比色法测定股骨中磷的含量,氟离子选择电极法检测股骨中氟的含量。

1.3 统计学方法实验数据通过SPSS 26.0进行统计分析。氟中毒组与对照组及丁酸钠组与氟中毒组均采用独立样本t检验处理数据,结果以均数±标准差表示,P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般情况实验期间,各组小鼠无患病及死亡情况发生,摄食、饮水、皮毛及行为活动未见明显差异,体质量均呈现上升趋势。实验结束时,氟中毒组与对照组相比,小鼠终末体质量显著降低(P<0.01);丁酸钠组与氟中毒组相比,小鼠终末体质量明显高于氟中毒组(P<0.05),见图1A。

图1 各组小鼠终末体质量和门齿变化Fig.1 Changes in final body weight and incisor of mice in each group

此外,对照组小鼠门齿表面光滑有光泽,牙面呈棕黄色,半透明状,牙齿无破损,无氟斑牙形成(图1B);其他两组小鼠均出现不同程度氟斑牙,氟中毒组左右门齿可见棕白横纹,牙齿表面着色不匀(图1C);丁酸钠组部分小鼠门齿光泽减退,表面粗糙,呈白垩样改变(图1D)。

2.2 各组小鼠骨小梁Micro-CT参数表1结果显示,氟中毒组小鼠的Tb.BMD、BV/TV、Tb.N三项指标均显著低于对照组(P<0.01或P<0.05),而Tb.SP和SMI均明显增高(P<0.05)。丁酸钠组与氟中毒组相比,丁酸钠组各项指标中,仅Tb.BMD显著增高(P<0.05)。

表1 各组小鼠股骨骨小梁物理参数Tab.1 Physical parameters of femoral trabecular bone of mice in each group ±s,n=3

表1 各组小鼠股骨骨小梁物理参数Tab.1 Physical parameters of femoral trabecular bone of mice in each group ±s,n=3

注:氟中毒组与对照组比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01;丁酸钠组与氟中毒组比较,#表示P<0.05

组别对照组氟中毒组丁酸钠组SMI 1.02±0.29 1.72±0.12*1.67±0.05 TB.BMD(g/cm3)0.60±0.07 0.38±0.02**0.46±0.03#BV/TV(%)23.28±2.27 12.73±1.32**12.83±0.25 Tb.Th(mm)0.055±0.003 0.051±0.002 0.053±0.000 Tb.N(mm-1)4.10±0.67 2.23±0.38*2.45±0.18 Tb.SP(μm)0.18±0.02 0.28±0.04*0.25±0.01

2.3 各组小鼠骨小梁三维结构由图可见,对照组小鼠股骨骨小梁结构紧密,粗细均匀,连续性良好,网状结构正常(图2A)。氟中毒组骨小梁结构稀疏、粗细不均,部分区域出现骨小梁断裂和缺失,呈现明显的骨微结构破坏(图2B)。丁酸钠组与氟中毒组相比,骨小梁结构相对紧密,虽也呈现出骨微结构破坏,但其程度相对较轻(图2C)。

图2 各组小鼠股骨骨小梁三维结构Fig.2 Three-dimensional structure of femoral trabecular bone of mice in each group

2.4 各组小鼠胫骨骨结构强度生物力学测试结果显示,氟中毒组小鼠的胫骨骨结构强度显著低于对照组(P<0.01)。丁酸钠组与氟中毒组相比,骨结构强度高于氟中毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 各组小鼠胫骨骨结构强度Fig.3 Tibia bone structure strength of mice in each group

2.5 各组小鼠股骨骨矿含量与对照组比较,氟中毒组小鼠骨钙、骨镁、骨锌含量均显著降低(P<0.01或P<0.05),骨氟和骨磷含量均明显增高(P<0.01)。丁酸钠组小鼠骨钙、骨镁、骨锌含量均高于氟中毒组(P<0.01或P<0.05),而骨氟和骨磷含量均低于氟中毒组(P<0.01或P<0.05)。

3 讨论

在我国,地方性氟中毒地区分布范围广,潜在受累人数多,属全身中毒性疾病,其典型病症为以骨代谢紊乱为主的氟骨症[15]。本次研究使用高氟自来水制备饮水型氟中毒小鼠,结果可见,氟中毒小鼠出现不同程度的氟斑牙,且骨组织中氟含量显著增加,说明氟中毒模型制备成功。

表2 各组小鼠股骨骨矿含量Tab.2 Femoral bone mineral content of mice in each group ±s,n=8

表2 各组小鼠股骨骨矿含量Tab.2 Femoral bone mineral content of mice in each group ±s,n=8

注:氟中毒组与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;丁酸钠组与氟中毒组比较,#P<0.05,##P<0.01

分组对照组氟中毒组丁酸钠组氟(μg/g)1 224.08±114.84 2 728.99±480.94**1 934.87±278.35##钙(mg/g)177.15±46.24 132.81±26.06*160.39±18.42#磷(mmol/g)3.23±0.74 6.69±0.85**5.74±0.72#镁(mg/g)4.60±1.05 1.79±0.61**2.83±0.67##锌(μg/g)179.48±42.67 139.75±16.30*183.00±19.52##

已有研究[16-17]显示,氟对骨组织的影响呈双向病理变化,即在低剂量条件下氟可激活成骨细胞,促进成骨作用;反之则抑制成骨过程。本次实验观察到,氟中毒小鼠骨钙含量显著降低,同时伴有镁、锌元素含量的降低及骨磷含量的增加,说明高氟条件下,实验小鼠呈现骨矿代谢紊乱状态[18-19];此外,三维立体影像显示,氟中毒小鼠股骨骨小梁结构稀疏、粗细不均,部分区域出现骨小梁断裂和缺失,呈现明显的骨微结构破坏,同时骨CT参数变化也印证了上述骨小梁结构的破坏性改变,这与BIAN等[20-21]的研究结果相似。正因如此,生物力学测试结果就正好解释了为什么氟中毒小鼠的骨结构强度显著降低。

近些年研究发现,短链脂肪酸在调控骨代谢方面作用积极,并可作为骨质疏松症防治的有效干预措施之一。作为短链脂肪酸的重要成员,丁酸及其盐类在增加骨量、改善骨微结构和预防骨质疏松等方面已得到动物实验证实[26]。其可能机制:一是通过诱导破骨前体细胞代谢的重编程,或通过诱导调节性T细胞间接抑制破骨细胞分化,减少破骨细胞数量,调节骨稳态;二是,经由Wnt信号通路促进成骨细胞分化,减少骨质流失,改善骨微结构[24];三是,激活细胞核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路,增强细胞抗氧化能力[25-26]。既然如此,本研究中丁酸钠纠正氟中毒小鼠骨矿含量紊乱、修正骨小梁物理参数及改善骨微结构等结果,均可能与上述骨代谢调节机制密不可分。还需指出的是,丁酸钠能显著降低氟中毒小鼠骨氟含量,这就提示,丁酸钠通过干扰氟吸收或促进氟代谢亦可能是其拮抗氟毒性的机制之一。

总之,丁酸钠可以缓解氟中毒小鼠骨矿含量紊乱状态,改善骨微结构,增强骨结构强度。

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