线粒体基于HUR/PIM1信号通路在高血压血管内皮细胞损伤中的机制

尹磊 蒋志明 杨慧琼 刘燕飞 郑学斌

长沙市第四医院心血管二科（长沙 410000）

高血压是常见的慢性疾病，调查显示欧洲和美国等发达国家的高血压发病率高达20%，临床特征血压升高和心脑血管疾病[1-2]。而其作用的分子机制尚未明确。血液循环和免疫系统的重要组成部分，血管内皮细胞广泛涉及生物过程，包括调节血压，血管形成，纤溶和炎症[3-4]。研究[5]表明血管内皮细胞功能障碍在高血压的发生发展中起重要作用。内皮细胞不仅充当物理屏障，还分泌多种影响血管舒张和收缩功能的物质，高血压期间，内皮细胞受损增加[6]。因此，研究血管内皮细胞在高血压发生发展中的分子机制有助于提高高血压的诊治水平。

线粒体是高度动态的，多任务的细胞器，不断地延长（融合）和分裂（裂变），动力蛋白相关蛋白1（Drp1）是线粒体裂变的主要调控因子[7]。与动力蛋白相关的GTPase经历了许多步骤来介导线粒体裂变，裂变/融合平衡的中断（主要是向裂变的转变）扰乱了细胞生理学，并与多种疾病有关，包括心血管系统中的疾病[8]。各种压力因素如高糖、缺氧和氧化应激已被证明可诱导内皮细胞中依赖Drp1的线粒体裂变并介导内皮病变，包括内皮依赖性松弛受损、微血管减少以及伤口愈合和血管生成缺陷[9]。Mdivi-1是Drp1的选择性抑制剂，可在GTPase结构域外结合到参与寡聚物组装的表面上，从而抑制Drp1 GTPase激活[10]。Drp1以及线粒体裂变在内皮炎症中的机制贡献尚未明确。

血管生成是由HuR调控的癌症发展的重要方面之一，参与血管生成相关基因的调控。丝氨酸/苏氨酸激酶（PIM1）在细胞存活、增殖和分化中具有多种生物学作用[11]。PIM激酶在多种类型的肿瘤细胞中增强细胞存活并抑制细胞凋亡。研究表明PIM1可促进内皮迁移和血管生成，并抑制细胞毒性[12]。在本研究基于HUR/PIM1信号通路研究线粒体在高血压血管内皮细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系培养人脐血管内皮细胞（HUVECs）购自ATCC，细胞在M199培养基中生长，培养基有20%胎牛血清、50 μg/mL重组人内皮细胞生长因子、25 U/mL肝素、100 U/mL青霉素和0.1 U/mL链霉素在37℃，5% CO2中。第3～6代的HUVEC用于所有实验。将静止HUVECs随机分为3组：control组；AngⅡ组（1 mmol/L）；Mdivi-1（25 μmol/L Mdivi-1+1 mmol/L AngII）组。

1.2 细胞活力测定使用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞活力。将HUVEC以2×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中。24 h以下以不同浓度的 0.01、0.1、1、10 mmol/L AngⅡ（Sigma）的处理，10 μL CCK-8加入到孔中，温育在37℃下3 h。Spectra Max 190酶标仪（Sunnyvale，USA）进行比色分析，并在450 nm波长处测量吸光度。

1.3 线粒体形态染色采用线粒体选择性探针，检测线粒体形态。药物处理24 h后，将活细胞与50 nmol/L丝粒体追踪器在37℃下孵育30 min。孵育后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞3次。使用共聚焦激光扫描显微镜观察波长为590/516 nm时的荧光。

1.4 线粒体膜电位通过JC-1染料用于测量线粒体膜电位。JC-1是一种阳离子染料，在线粒体中表现出电位依赖性积累，在活细胞中由红色荧光表示。在细胞凋亡过程中，JC-1作为单体存在于细胞质中，由绿色荧光表示。因此，红色/绿色荧光强度比表明线粒体膜电位的变化。

1.5 流式细胞术将HUVEC用胰蛋白酶消化、收集并用预冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）通过流式细胞术测量细胞凋亡。早期凋亡细胞通过Annexin V单阳性染色鉴定，坏死细胞通过碘化丙啶单阳性染色鉴定，晚期凋亡细胞通过碘化丙啶和Annexin V双阳性染色鉴定。使用流式细胞仪进行检测，结果使用ModFit v3.2软件进行分析

1.6 内皮细胞的迁移Tinza对HUVEC细胞迁移的使用transwell室进行评估，将悬浮有无血清ECM的HUVEC细胞以2×104的密度接种在板中，底部腔室充满0.6 mL新鲜ECM。HUVEC细胞在37℃培养24 h。用棉签除去膜表面的非迁移细胞后，用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色迁移至下膜表面的HUVEC细胞。图像通过EVOS XL Core拍，使用Image-Pro-Plus 6.0分析迁移细胞。

1.7 体外血管形成试验体外血管生成研究中，体外试管形成试验使用ibidi载玻片进行。将200 000个HUVEC悬浮在1 mL M199培养基。细胞培养基中补充有指定浓度的Tinza。将细胞悬液（50 μL）施加到每个载玻片孔中，并在37℃的加湿室中孵育。在细胞接种后0、0.5、3、6、9 h，以10倍放大率对管形成进行成像。9 h后用Image J软件定量总管长。

1.8 实时定量荧光PCR使用RNAiso Plus试剂提取HUVEC中的总RNA，通过PrimeScript RT Master Mix试剂盒反转录为cDNA，GAPDH作为内参，每个样本3个复孔。引物通过生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根据制造商的说明，数据处理根据公式2-ΔΔCT计算两组间目的基因相对表达含量的变化。

1.9 蛋白质印迹分析使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Sigma Chemical Co）的RIPA裂解缓冲液（Beyotime Biotech）中裂解HUVEC细胞。细胞裂解物通过8%～12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，后转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。膜在室温下在5%脱脂牛奶中封闭1 h，与以下一抗一起孵育Drp-1、ROS、HUR（1∶500）和 PIM1均来自 Cell Signaling Technology（CST）；β-actin（Santa）。洗涤后，将二抗即HRP偶联的抗兔或抗小鼠（CST），在室温下孵育1 h，将膜使用化学发光试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行可视化。

1.10 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行分析，所有资料以（）表示，多组间差异通过单因素方差分析，数据表示为来自三个独立实验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AngII和Mdivi-1对HUVEC细胞活力的影响CCK-8测定测量AngⅡ对细胞活力的影响，选择了0.01、0.1、1、10 mmol/L AngⅡ对内皮细胞增殖的抑制作用。结果表明，AngⅡ（1 mmol/L）以剂量依赖性方式降低HUVEC细胞活力，Mdivi-1升高了HUVEC细胞活力，见图1A-B。蛋白质印迹分析显示，在用0.1、1、10 mmol/L AngⅡ处理24 h后，Drp-1蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1C-D。

图1 AngⅡ和Mdivi-1对HUVEC细胞活力的影响Fig.1 Effects of AngⅡand Mdivi-1 on the viability of HUVEC cells

2.2 Mdivi-1对AngⅡ诱导的HUVEC线粒体形态和膜电位的影响免疫荧光结果，与control组相比，AngⅡ组导致线粒体形态从细长的细胞器改变为均匀的点状细胞器，Mdivi-1组线粒体再次被拉长，见图2A。JC-1的结果显示AngⅡ组线粒体膜电位降低，Mdivi-1组线粒体膜电位升高，见图2B。AngⅡ组Drp1蛋白表达增加，提示线粒体发生了裂变，Mdivi-1组HUVECs时，Drp1的表达被抑制。裂变介导的碎片与细胞中ROS的产生有关，与control组相比，AngⅡ处理24 h的ROS水平有统计学意义，Mdivi-1抑制Drp1显著降低了AngⅡ诱导的ROS的产生，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2C-E。

图2 Mdivi-1对AngII诱导的HUVEC线粒体形态和膜电位的影响Fig.2 The effect of Mdivi-1 on AngII-induced HUVEC mitochondrial morphology and membrane potential

2.3 Mdivi-1对AngⅡ诱导的HUVEC凋亡、迁移及血管生成的影响流式细胞术分析细胞凋亡，数据显示AngⅡ组HUVEC的凋亡率增加。Mdivi-1降低细胞凋亡，见图3A-B。Transwell试验数据表明，AngⅡ组通过腔室膜的HUVECs数显着高于control组，Mdivi-1组与control组HUVECs数量无显著差异，见图3C-D。在网络形成试验中，结果表明Mdivi-1抑制了AngⅡ诱导的HUVEC细胞的管形成，管状结构的数量减少并且管状结构不稳定，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3E。

图3 Mdivi-1对AngII诱导的HUVEC凋亡、迁移及血管生成的影响Fig.3 Effects of Mdivi-1 on AngII-induced HUVEC apoptosis，migration and angiogenesis

2.4 Mdivi-1对AngⅡ诱导的HUVEC细胞HUR/PIM1的影响qPCR、Western blot检测发现在HUVEC细胞HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量，AngⅡ组HUVEC的HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量升高，Mdivi-1组细胞HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4A-E。

图4 Mdivi-1对AngII诱导的HUVEC细胞HUR/PIM1的影响Fig.4 The effect of Mdivi-1 on AngII-induced HUR/PIM1 in HUVEC cells

3 讨论

高血压是由环境和遗传因素相互作用引起的复杂疾病[13]。研究[14]表明线粒体与高血压的发生发展密切相关，其在血管组织中的表达显著增加。此外，血管内皮细胞损伤和功能障碍是高血压的重要迹象，线粒体在内皮细胞损伤和功能障碍中起重要作用[15]。本研究实验表明Mdivi-1抑制AngⅡ诱导的HUVECs的HUR/PIM1信号通路及其凋亡、迁移和血管生成，减少ROS产生。

本研究显示AngⅡ处理上调了HUVEC中Drp1的蛋白质水平。Drp1蛋白表达的增加表明线粒体经历了裂变事件，Drp1的增加与线粒体碎片增加相一致[16]。与对照相比组，用AngⅡ处理导致线粒体形态从细长到均匀碎片细胞器的变化。最近研究显示Mdivi-1治疗抑制Drp1从而降低了AngⅡ诱导的内皮功能障碍，通过减少ROS的产生，抑制凋亡和迁移能力，改善线粒体形态，细胞凋亡是通过线粒体内在途径进行的，如线粒体膜电位的丧失，促凋亡[17]。本研究显示AngⅡ和Mdivi-1孵育HUVECs时，Drp1的表达显著降低，这与最近的研究结果一致[18]。大量研究[19]表明，AngⅡ可以通过增加ROS的产生来诱导细胞功能障碍，ROS与线粒体功能障碍密切相关。本研究表明与control组相比，AngⅡ治疗显著提高了HUVECs的ROS水平。AngⅡ促进血管系统中氧化应激的产生，是内皮细胞的关键介质功能障碍和凋亡[20]。此外，AngⅡ诱导的线粒体膜电位降低是细胞凋亡的标志，细胞凋亡是因形态学和生化变化而致细胞死亡的主要模式[21]。研究[22]表明细胞凋亡是以细胞收缩、膜起泡和染色质凝结为特征的细胞死亡类型。当线粒体功能减弱或细胞内ATP耗尽时，AngⅡ诱导的内皮细胞过度凋亡导致内皮单层的剥除。本研究结果显示AngⅡ处理诱导HUVECs线粒体形态及膜电位降低，细胞凋亡和迁移能力增加，血管形成升高。而Mdivi-1可以保护AngⅡ处理诱导HUVECs细胞功能障碍，其线粒体形态改善及线粒体膜电位升高，HUVEC细胞的凋亡、迁移和血管形成能力降低。

研究[23]显示HuR在巨噬细胞中的促血管生成作用已在巨噬细胞Hur敲除小鼠中得到证实，微血管生成显著减弱。PIM蛋白家族是原癌基因家族，在多种恶性肿瘤中表现出增加的表达水平。PIM激酶在多种类型的肿瘤细胞中增强细胞存活并抑制细胞凋亡[24]。研究[25]表明 PIM1可促进内皮迁移和血管生成，并抑制细胞毒性。此外，研究[26]显示HuR-PIM1轴对维持血管生成转换非常重要。本研究显示AngⅡ处理诱导HUVECs细胞HUR/PIM1信号通路显著升高，而Mdivi-1可以降低了AngⅡ处理诱导HUVECs细胞HUR/PIM1信号通路的表达。此外，本研究存在一定的局限性，只有通过一种细胞进行验证，并还需要后续动物实验进行补充。

综上所述，本研究结果显示线粒体抑制剂Mdivi-1降低了AngⅡ诱导HUVECs细胞HUR/PIM1信号通路，Mdivi-1减少了高血压血管内皮细胞凋亡、迁移及血管生成，这表明抑制了线粒体及相关途径，可为预防心血管疾病（如高血压）中的内皮功能障碍提供新策略。