钒钼黄-连续流动分析仪法测定饲料中总磷含量

■唐思宇 张丽萍 王久荣 袁红朝 贺 珍 耿梅梅 陈 闻

（中国科学院亚热带农业生态研究所重点实验室，湖南长沙 410125）

磷是生命活动必需的基础养分，对畜禽的生长、发育、繁殖及各种器官的修补有极重要的作用。若畜禽日粮中磷含量不足或过量，将对畜禽的健康、生长、发育、繁殖、生产水平及产品品质造成不同程度的影响[1-8]，因此，总磷含量是评价饲料质量的重要指标之一。但各种饲料中总磷含量及品质差异较大，为保证饲养畜禽的日粮中磷含量达到并保持一定水平，快速准确检测饲料中总磷含量非常必要[9]。目前，国内外现行有效测定饲料中总磷含量的技术规范有ISO 6491—1980《动物饲料 磷总含量的测定 分光光度法》[10]、EN 15510—2007《动物饲料 用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-AES）测定钙、钠、磷、镁、钾、铁、锌、铜、锰、钴、钼、砷、铅和镉含量》[11]、GB/T 6437—2018《饲料中总磷的测定 分光光度法》[12]和DB21/T 3059—2018《饲料中铜、锌、铁、锰、钙、磷、钠、镁、铅、铬、镉和砷含量的测定电感耦合等离子体发射光谱法》[13]等。这些标准均能保证测定总磷含量结果的准确性，但也存在一些不足，如分光光度法存在样品和试剂的消耗量大、检测流程繁琐、耗时长、工作效率低[14-16]；电感耦合等离子体发射光谱法测定简便，但仪器较为昂贵，且该仪器对磷元素的响应强度较弱（磷元素的检测波长在紫外区），普及率不高。基于郎伯比尔定律的连续流动分析仪作为一种新型的分析手段，因其自动化程度高、分析速度快、精度高且试剂耗量少而备受环境、生态及农业科学领域广泛使用，仪器的普及率极广。目前采用的钼蓝显色原理的连续流动分析仪法已被广泛应用测定水、植物及土壤等样品中磷含量[17-24]，但存在结果准确度易受样本基体的酸度影响，需严格控制试验条件，线性范围较窄，常常需要稀释样品才能检测，这些都无形中加大了人力与物力的耗损。为了简化饲料总磷含量检测步骤、节省检测成本、提高检测效率，试验拟将国标GB/T 6437—2018 规定的具有线性范围宽、允许样本酸度范围大的钒钼黄比色法在连续流动分析仪上拓展。为了检验钒钼黄-连续流动分析仪法测定饲料中总磷含量的科学性、正确性与可行性，通过优化检测波长、显色剂用量、用酸种类等条件；考察了线性范围、检出限、精密度及回收率等方法参数；建立钒钼黄-连续流动分析仪快速准确测定饲料中总磷含量的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试饲料样品鱼饲料（1 号～5 号）、鸭饲料（6 号～11号）、鸡饲料（12号～17号）、猪饲料（18号～22号）由广东某饲料企业提供，原料（23 号～24 号）及猪饲料（25号～34号）由天津某饲料企业提供，分别用自封袋密封并写上对应编号放入阴凉处保存，各取100 g 样品经粉碎后过40 目筛待测；供试质控样品QC[CFAPA-QC 076B-1，（0.47±0.012）%]由大连中食国实检测技术有限公司生产。

1.2 试验试剂

硫酸、偏钒酸铵、四水合钼酸铵、硝酸、高氯酸等试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂，十二烷基磺酸钠（SDS）为Sigma-Aldrich试剂公司产品，总磷标准溶液[GSB 04-1741-2004（b），1 000 mg/L]为国家有色金属及电子材料分析测试中心标准样品，试验用水为去离子水。

1.3 试剂配制

1.3.1 钒钼酸铵-硝酸试剂

称取1.25 g 偏钒酸铵，加200 mL 水加热溶解，冷却后，在通风橱内加入250 mL硝酸；另称取25.00 g四水合钼酸铵，加400 mL 水加热溶解，冷却后将2 种溶液混合，用水定容至1 000 mL，避光保存，出现沉淀则不能继续使用。

1.3.2 钒钼酸铵-硫酸试剂

称取2.40 g偏钒酸铵至1 000 mL烧杯中，加入约700 mL水，再缓慢加入120.0 mL硫酸，待溶液冷却至室温，再加入32.00 g四水合钼酸铵，搅拌至完全溶解后，用水定容至1 000 mL，摇匀，避光保存，出现沉淀则不能继续使用。

1.3.3 硫酸溶液

量取10.00 mL 硫酸加入到约800 mL 水中，再加入2.00 g 十二烷基磺酸钠（SDS），试剂完全溶解后，用水定容至1 000 mL。

1.4 试验仪器

连续流动分析仪（AA3，Seal Analytic，德国）；紫外可见分光光度计（UV 2600，Shimadzu，日本）；威立雅实验室超纯水机（PURELAB Classic，ELGA，英国）；电子天平（ME602，Mettler Toledo，美国）；一般试验常用仪器和设备。

1.5 试验条件

连续流动分析仪测量条件：清洗比设定为2（进样时间48 s，清洗时间24 s）；测样速率为50 样次/h，滤光片为410 nm。紫外可见分光光度计测量条件：10 mm光程，测定波长400 nm。

1.6 试验原理

连续流动分析仪法和紫外可见分光光度计法的检测原理相同：饲料样品经高温消解，有机物被氧化分解，有机磷转化为正磷酸盐（PO43--P），再采用比色法进行测定；结合钒钼黄显色原理和连续流动分析仪的仪器特性，设计试剂流路，即硫酸溶液进入流路体系，调节显色体系的酸度，样品再进入体系，随后钒钼酸铵显色剂进入体系，混合液通过37 ℃加热池恒温，完成显色后，进入检测池，磷钼黄络合物在波长410 nm进行比色测量，其试剂流路见图1。

图1 钒钼黄-连续流动分析仪法测定饲料中总磷含量试剂流路

1.7 样品前处理及数据分析

取饲料样品1、7、13、19、24、27号各称取7份独立试样，其余饲料样品及饲料质控样品QC[CFAPA-QC 076B-1，（0.47±0.012）%]各称取3份独立试样，按照标准GB/T 6437—2018 规定湿化法对样品进行前处理，并制备7个试剂空白对照。采用Excel 2010软件对检测数据进行统计分析。

1.8 试样测定

1.8.1 工作曲线（见表1）按照仪器测定方法分取总磷标准溶液[GSB 04-1741-2004（b）]制备标准系列溶液；以7次空白结果的3倍标准偏差为检出限。通过调整进样管管径可调整测样检测范围。工作曲线及检出限见表1。

表1 钒钼黄-连续流动分析仪法测定饲料中磷的工作曲线及检出限

1.8.2 测定步骤

钒钼黄-连续流动分析仪法测定：取待测空白液、待测液适量（大于3 mL）按顺序放入样品盘中，参照仪器使用说明书，按照试剂流路（见图1）连接管路和试剂流路，使待测指标的响应增益值达到分析要求，编辑测定方法、选择合适的测样速率、清洗比，待基线稳定后依次测定标准系列溶液、空白液和待测液。钒钼黄-分光光度法按照标准GB/T 6437—2018 规定进行比色测定。

2 结果与分析

2.1 波长选择（见表2）

表2 不同波长对磷-钒钼黄络合物的吸收结果（Abs）

根据标准GB/T 6437—2018 规定比色波长为400 nm，而连续流动分析仪采用滤光片进行检测。通常认为400 nm以下是紫外光分析区域，400～760 nm是可见光波长分析区域，本试验设计在10 mm光程的紫外可见分光光度计上，对磷含量为0、1.00、2.00、5.00、10.0、15.0 mg/L 的磷-钒钼黄络合物在波长390、400、410、420、480、660 nm波长下进行检测，检测结果表明400、410、420 nm波长下零点吸收强度稳定，其余浓度在同条件下吸收强度衰减速度较缓；可选择410 nm或420 nm滤光片作为检测波长，测定结果见表2。

2.2 钒钼黄法显色剂用量、用酸种类改良（见表3）

表3 等同仪器条件下，偏钒酸铵、酸、钼酸铵试剂用量变化及Prime测量结果

依据标准GB/T 6437—2018 钒钼黄显色剂配制方案，在相同仪器条件（0.32 mL/min 进样管，磷工作液含量为50 mg/L，增益为10，滤光片为410 nm）下，做Prime（Prime结果代表仪器响应值，相同条件下，响应值越高，表示该参数下仪器灵敏度越好），考察偏钒酸铵用量、酸种类、钼酸铵用量，Prime 测定结果见表3。结合表3测量结果及显色剂配制简便性，确认钒钼黄显色剂为序号4的配制方案，即1 000 mL显色剂中含2.40 g偏钒酸铵、120 mL硫酸及32.00 g钼酸铵。

2.3 样品允许酸度（见表4）

表4 等同仪器条件下，水配制标线测定不同酸度基体结果

鉴于饲料样品经硝酸-高氯酸消解赶酸后，消解液中所剩高氯酸体积不一致，导致上机液体的基体酸度发生变化，考察了该反应体系对检测样品酸度的允许范围。以水为基体配制0、1、5、10、50、100、120、150 mg/L标准系列溶液，测定以1%、2%、4%、5%、8%及10% 高氯酸溶液为基体制备的磷含量为5 mg/L的待测溶液。测定结果显示在高氯酸含量不大于10%时，测定结果的相对偏差小于2%，表明该方法允许样品酸度基体范围较宽，在酸度基体不一致情况下，测定结果稳定准确，结果见表4。

2.4 精密度试验结果（见表5）

表5 钒钼酸铵-连续流动分析仪法精密度结果

随机选择6个试样待测原液[包括：1个鱼饲料样品（1 号）、1 个鸭饲料样品（7 号）、1 个鸡饲料样品（13 号）、2个猪饲料样品（19号、27号）、1个原料样品（24 号）]，采用连续流动分析仪对同一样品重复测定6 次，结果见表5，变异系数为0.14%～0.85%，均小于1%，表明仪器精密度良好。

2.5 回收率试验结果（见表6）

选择6个试样（1号样、7号样、13号样、19号样、24号样、27号样）各称取3份独立试样进行前处理，做加标回收试验。鉴于本试验采用的是标准GB/T 6437—2018规定的湿法前处理方法，为经典前处理方法，因而本方法主要考察仪器回收率。每个样品稀释5倍，并同时制备4份，其中3份分别加入低（20 mg/L）、中（40 mg/L）、高（80 mg/L）3个浓度水平的磷标准溶液；制备好的加标待测液同时经连续流动分析仪测量。由于样品制备过程为稀释后定容，体积相同，则加标后测定值减去待测液测定值，其差值同加入值之比即为样品加标回收率。由表6 可知，钒钼黄-连续流动分析仪法测定饲料样品中磷含量回收率为96.4%～101.5%，结果满足标准GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》[25]中浓度含量水平＞100 mg/kg，回收率范围为95%～105%的要求。

表6 钒钼黄-连续流动分析仪法回收率试验结果

2.6 准确度试验结果（见表7）

按照标准GB/T 6437—2018 规定前处理步骤消解34 个实际饲料样品及质控样品QC[CFAPA-QC 076B-1，（0.47±0.012）%]，每个样品重复制备3份独立试样进行检测，并计算试样中总磷含量，采用Excel 2010 软件分析分光光度计法和连续流动分析仪法这两种方法检测结果的绝对误差和相对误差，来衡量连续流动分析仪的准确度（绝对误差=│连续流动分析仪检测结果-分光光度计检测结果│，相对误差（%）=绝对误差/分光光度计检测结果×100），2 种仪器测定结果的重现性均小于5%，绝对误差范围为0～0.090%，相对误差在5%以内，质控样品总磷含量均在参考范围内，结果见表7。利用Excel 2010 中COVARIANCE.P 函数对表7中检测结果进行方差法检验得到P=0.57；t-test 函数对表7 中检测结果进行t检验得到P=0.88；P＞0.05，表明这两种方法无显著差异，钒钼黄-连续流动分析仪法可应用于饲料样品中总磷含量的检测。

3 讨论

3.1 两种方法比较

在实际操作过程中，国标方法GB/T 6437—2018中显色剂采用硝酸作为酸化剂，而硝酸具有挥发性，对人体有伤害，必须在通风橱内操作；偏钒酸铵与钼酸铵必须分开配制，且在完全溶解后，才可混合，否则会导致试剂短时间内极难完全溶解，配制1 000 mL显色剂至少需2 h；按照标准GB/T 6437—2018中显色剂用量，1 000 mL 显色剂仅可检测100 样次，消耗试剂量大。本试验将显色剂中酸改为等当量酸度的硫酸时，硫酸为难挥发性酸，可在常规实验室内配制试剂，将偏钒酸铵、水、硫酸及钼酸铵试剂依次加入同一容器配制（无需分开配制），简化了显色剂配制步骤，配制1 000 mL 显色剂仅需15～30 min，而1 000 mL显色剂可检测1 200 样次，试剂的使用效率提高了12 倍。国标方法检测需要人工逐个检测，平均测样速率为30 样次/h；连续流动分析仪法检测实现自动化进样、在线检测，无需人工值守，平均测样速率50 样次/h，极大提高了检测效率，降低了人力成本，实用性高。

钒钼黄-连续流动分析仪法与标准GB/T 6437—2018分光光度法检测原理相同。由表1可知，连续流动分析仪法测定饲料磷含量的线性范围0～150 mg/L，较国标方法0～15 mg/L提高了10倍，消解液可直接检测，节省了前期样品准备的人工成本，避免了分光光度法人工逐个取样、显色、摇匀、稀释等繁琐步骤，简化了试验流程，提高了检测效率。且可根据样品含量调整线性范围，对于低含量样品也可准确测定；基于连续流动分析仪具有自动化程度高、连续流进样及在线恒温显色测量等特点，待测样品与标准系列样品的进样体积、显色条件、检测条件几乎一致，不受外界环境影响，使得检测结果更加稳定可靠。由表5、表6 结果可知，连续流动分析仪法检测饲料中总磷含量精密度（RSD%＜1%）与准确度（回收率介于96.4%～101.5%）良好；由表7 可知，连续流动分析仪法与国标法测量结果无显著差异，钒钼黄-连续流动分析仪法应用于饲料中总磷含量的测定是可行的，结果准确可靠。

表7 连续流动分析仪与紫外可见分光光度计测定饲料中总磷含量结果比对(%)

3.2 连续流动分析仪检测总磷的注意事项

使用连续流动分析样品时，试剂流路管道长，存在流体阻力，会造成流速阻滞，仪器基线抖动，因此配制试剂时，润滑剂（SDS）一定要加足量且全部溶解，且含有润滑剂的溶液需保证使用期间澄清透亮，以保证仪器管路顺滑、基线平稳，检测数据结果准确[26]。在编辑运行文件时，要选择合适清洗比，使仪器带过（Carryover）小于2%，以避免样品间相互干扰；每10 样次插入一个基线校正，每20 样次插入一个漂移杯，以校正测量过程中仪器与试剂的漂移变化[27]。在样品测试期间，虽然钒钼黄比色法允许样品酸度范围大，建议标准溶液配制基体与样品基体尽量一致，保证标准曲线与样品显色条件一致，使测量结果更加准确可靠。

4 结论

研究结果表明，钒钼黄-连续流动分析仪法测定饲料中总磷含量的线性良好（线性范围0～150 mg/L，可直接检测大部分饲料消解液，提高了检测效率），R2＞0.999，检出限不大于0.035 mg/L；变异系数＜1%，回收率介于96.4%～101.5%，采用t-test检验分析连续流动分析仪法和分光光度法测量34个实际饲料样品的结果，发现这两种方法测量饲料总磷含量无显著差异，表明钒钼黄-连续流动分析仪法用于饲料样品中总磷含量测定是可行的，并能够满足饲料中总磷含量检测的质量要求。钒钼黄-连续流动分析仪测定饲料中总磷含量的方法，具有自动化程度高、分析速度快、显色条件稳定、操作简便、精密度高、准确可靠、试剂消耗量少及对环境友好等特点，对快速准确检测饲料总磷含量有重大的实际应用意义，也可借鉴用于植物样品总磷含量的检测。