表观遗传学在皮肤鳞状细胞癌中的研究进展

张 俐，缪 旭，张冬梅，刘念念

（1.南通大学第二附属医院皮肤科，江苏 南通 226001；2. 南通大学第二附属医院临床研究中心，江苏 南通 226001）

表观遗传是在不带来基因组序列改变的情况下修改基因表达的过程，具有可遗传性，主要有DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA调控等，对细胞分化、个体发育过程的调节有重要意义［1］。当修饰过程出现异常时，能导致疾病发生，如癌症。皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是常见的非黑色素瘤皮肤癌，环境和自身等多种因素的相互作用，除了诱发p53、NOTCH、CDKN2A、TERTp等基因突变导致遗传改变，还伴随着复杂的信号通路改变及表观遗传学改变，遗传和表观遗传学改变逐步累积的过程导致了cSCC的发生（如图1），且近20%的皮肤癌的死亡都归因于cSCC［2，3］。近期研究证据表明，表观遗传可能是cSCC发生和进展的关键因素，本文就表观遗传修饰在cSCC中的调控作用作一综述。

图1 皮肤鳞状细胞癌机制图

1 表观遗传在皮肤鳞状细胞癌发生中的作用

1.1 DNA甲基化与皮肤鳞状细胞癌 DNA甲基化是甲基基团被加成到DNA模板中的胞嘧啶核苷酸的过程［4］。目前已确定了3种催化该过程的DNA甲基转移酶（DNMT）：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。在DNA甲基化维持中发挥作用的酶主要是DNMT1，而在DNA从头甲基化中起作用是DNMT3a和DNMT3b［5］。当基因启动子上的CpG岛（CpG island，CGIs）由未甲基化状态改变为甲基化状态后，可作为一个停靠点结合能够改变染色质状态的蛋白质，或者影响原有组蛋白的共价修饰，进而导致肿瘤发生。

由CGIs的高甲基化所致的转录沉默是肿瘤相关基因失活的常见机制，而原癌基因通过显性突变或过量表达被激活成癌基因可造成双重打击［6］。在cSCC中，已经报道了启动子区域CGIs高甲基化的相关基因，包括细胞周期调节因子CDKN2A［7］、转录因子FOXE1［8］、Wnt信号调节因子SFRP［9］和FRZB［10］、肿瘤抑制基因Filip11［11］、胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂serpinB9［12］、凋亡阳性调节因子ASC［13］、G0S2［14］和DAPK1［15］及miRNA-204［16］等。此外，有学者对不同阶段的cSCC患者的DNA甲基化情况进行研究，从光化性角化病到低风险侵袭性和高风险非转移和转移性cSCC，结果显示在不同的cSCC阶段DNA甲基化发生了大量非连续变化，而低风险和高风险阶段的对比揭示了高风险肿瘤的表观遗传学特征，即DNA甲基化程度与肿瘤风险呈正相关，这一特征在临床上可用于肿瘤的早期检测、诊断和预后［17］。同时，针对特定基因启动子甲基化的药物可恢复基因转录而发挥抑癌作用。例如，中药槐耳可通过抑制CDKN2A和TP53的甲基化水平抑制cSCC的增殖、迁移和侵袭［7］。目前，去甲基酶也被认为是有希望治疗癌症的靶点。

1.2 组蛋白修饰与皮肤鳞状细胞癌 组蛋白由核心蛋白和连接蛋白H1组成，前者包括H2A、H2B、H3和H4等，可在后者作用下与DNA结合形成核小体，构成染色质的基本结构单位［18］。组蛋白尾部的N-端结构域可进行甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化等多种化学修饰，是转录后修饰的重要位点［19］。组蛋白修饰通过改变染色质的结构和功能，调控关键基因的转录，影响肿瘤的发生发展及对药物的敏感性［20，21］。此外，组蛋白修饰酶的异常活性引起的表观遗传学改变也与癌症表型的建立和维持有关，靶向药物通过干扰参与组蛋白修饰的酶活性为癌症治疗提供了组蛋白修饰疗法，是目前的研究热点［22］。

1.2.1 组蛋白甲基化与皮肤鳞状细胞癌 组蛋白尾部的赖氨酸残基（K）是组蛋白甲基化和乙酰化修饰的主要部位，位于赖氨酸H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79等处的组蛋白H3和位于H4K20位点的组蛋白H4是公认的赖氨酸甲基化位点，可进行单甲基化、双甲基化或三甲基化修饰。H3K4、H3K36和H3K79的双甲基化和三甲基化通常与基因激活有关，而H3K9、H3K27和H4K20的三甲基化通常与基因抑制有关［23，24］。组蛋白甲基化修饰需要赖氨酸甲基转移酶（KMTs）参与，目前有24种不同的KMTs被报道［25］。组蛋白甲基转移酶的突变和拷贝数异常（CNVs）已被证明是癌症中的常见现象，在cSCC中也有报道［26，27］。研究表明，KMTs的突变也可能与侵袭性cSCC的总体存活率低有关［27］。且另一项研究对原发性cSCC、转移性cSCC和正常皮肤组织进行了全外显子组测序，揭示了转移性cSCC中表观遗传调节因子的高突变：KMT2D （67%）、KMT2C （58%）、SETD2 （50%）、KMT2A （33%）和KAT6A（33%）［26］。KMT2D缺失导致组蛋白修饰H3 Lys 4 （H3K4）单甲基化（H3K4me1）和H3K27乙酰化（H3K27ac）广泛丢失，以及靶基因p63的表达减少，抑制上皮分化，促进cSCC发生［28］。zeste基因增强子同源物2 （EZH2），一种用于H3K27三甲基化（H3K27me3）的组蛋白甲基转移酶，可通过染色质凝聚导致基因沉默［29］。一项对cSCC细胞的研究表明，EZH2可能抑制先天免疫，从而抑制抗肿瘤免疫反应，并增加cSCC转移的风险［30］。

1.2.2 组蛋白乙酰化与皮肤鳞状细胞癌 组蛋白乙酰化水平由组蛋白乙酰基转移酶和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）共同调节，组蛋白乙酰化在核小体组装、基因转录和染色质状态改变等细胞生物学过程中发挥着重要的作用，而组蛋白乙酰基转移酶基因突变或HDAC异常表达往往与肿瘤发生相关。研究发现，T-LAK细胞源蛋白激酶（TOPK）通过上调HDAC1激活NF-κB途径促进细胞自噬，从而促进cSCC的恶性进展［31］。近年来，组蛋白去乙酰化酶 （HDAC） 抑制剂作为cSCC的表观基因组靶向疗法得到了越来越多的研究。

1.3 染色质重塑与皮肤鳞状细胞癌 染色质重塑受组蛋白修饰物和染色质重构体的调节，通过改变染色质、核小体、组蛋白或DNA的包装状态，改变染色质结构和位置，调控基因表达。染色质重构体是具有ATP酶活性的复合物，通过利用ATP水解的能量重排核小体，或通过在DNA上标记招募其他活性成分，如组蛋白修饰剂，最终导致基因激活或沉默，从而改变染色质的结构。染色质重塑复合物可根据ATP酶亚单位的序列和特征分为4个家族：SWI/SNF、CHD、ISW和INO80［32］。在 哺 乳 动 物细胞中，目前的数据表明体细胞中的SWI/SNF复合物可以分为3类：BAF（BRG1/BRM相关因子）、PBAF（多溴相关BAF）和ncBAF或GBAF（非典范BAF或GLTSCR1/1L相关BAF）［33］。有研究报道，cSCC中BRM和BRG1的蛋白的表达水平低于正常皮肤组织，而BRM和BRG1在AK和正常皮肤组织中的表达相似，并认为BRM和BRG1的缺失可能参与AK向cSCC进展的过程［34］。此外，Mancini 等人认为BRG1的低表达以及低SWI/SNF活性与低分化的cSCC相关［35］。也有研究指出，组蛋白修饰和核小体重塑可通过促DNA损伤修复和促凋亡蛋白募集来响应紫外线诱导的DNA损伤［36］，为cSCC治疗提供思考。

1.4 非编码RNA调控与皮肤鳞状细胞癌

1.4.1 microRNA与皮肤鳞状细胞癌 MicroRNAs是一种非编码RNA，长度约22bp，可通过促进信使RNA裂解和抑制蛋白质的翻译过程来改变内源性基因的表达水平［37］。MicroRNAs的差异表达谱已被报道在各种不同的癌症中，包括皮肤癌。研究发现，在cSCC中，miR-205和miR-203的表达是相互排斥的，miR-205在具有神经浸润、浸润性生长模式、结缔组织增生等预后不良特征的cSCC中表达，miR-205在临床上与局部复发和预后不良的cSCC相关；相反，miR-203在表现出与良好预后相关的组织特征的肿瘤中表达［38］。另一项研究表明，miR-221在cSCC中过表达，miR-221通过与PTEN相互作用而发挥致癌作用［39］。早期的一项研究对150多例cSCC组织进行定量RT-PCR检测，并与癌旁正常组织比较，发现miR-20a在cSCC中显著降低，且与TNM分期相关。此外，2019年发表的一篇综述表明，在cSCC中，存在一系列具有促癌功能的miRNAs和抑癌功能的miRNAs。肿瘤诱导物家族包括一大组miRNAs（例如miR-21、miR-205、miR-365、miR31、miR-186、miR-766、miR-142和miR-135B），它们一般作用于PTEN、PDCD4、GRHL3 HOXA9和RhoBTB，这些基因通过参与促进肿瘤增殖、侵袭、迁移、维持干细胞特性和阻碍凋亡等过程发挥促癌作用；在miRNAs（例如miR-34a、miR-125b、miR-181a、miR-148a、miR20a、miRNA-203、miR-204、miR-199a、miR-124和miR-214）抑癌家族中，有一些成员通过调控HMGB1、SIRT6、MMPs、MAP激酶、KRAS、LIMK1、c-myc、SHP2、CD44等基因，在促进细胞凋亡和衰老的同时参与调节细胞周期、上皮—间充质转化和干性等过程［40］。

1.4.2 长链非编码RNA与皮肤鳞状细胞癌 LncRNA是一种长度大于200 bp的非编码RNA，据报道，在人类中约有8%的lncRNA可以通过编码短肽来调节许多生物学过程，如细胞生长、抗凋亡、肿瘤迁移和侵袭，LncRNA的功能包括组蛋白修饰、染色质重塑、转录激活、转录干扰、核转运和细胞周期调节等［41］。目前发现一些LncRNA在许多肿瘤组织中异常表达，不仅对组织癌变倾向有一定的提示意义，而且还发现其对抗肿瘤耐药性有潜在影响［42］。

许多LncRNA在cSCC中异常表达，可通过不同机制调控肿瘤发生过程。例如，在cSCC过表达的LncRNA中，PICSAR（LINC00162）通过抑制ERK2的负性调控因子DUSP6机制促进cSCC细胞的增殖和迁移，并促进异体移植肿瘤的生长，而PICSAR可被P38MAPK抑制［43］，此外，PICSAR敲低通过下调整合素α2β1和α5β1的表达，增加了cSCC细胞对I型胶原和纤维连接蛋白的黏附，减少了cSCC细胞迁移［44］；MALAT1通过MALAT1-KTN1- EGFR轴并与c-myc相互作用参与肿瘤的形成［45］；LINC01048通过增加TAF15与YAP1启动子的结合来激活cSCC细胞中的YAP1进而发挥致癌作用［46］；HOTAIR通过海绵miR-326上调PRAF2的表达，促进cSCC细胞增殖、迁移和EMT过程［47］。研究显示，用THOR基因的靶向抑制剂IGF2BP1敲低A431细胞中的THOR基因可下调IGF2BP1依赖的mRNAs，进而抑制A431细胞的增殖及活性［48］。LINC00319在cSCC组织和细胞系中显著上调，并通过调节miR-1207-5p介导的细胞周期蛋白依赖性激酶3（CDK3）促进A431细胞的增殖、迁移和侵袭［49］。在cSCC低表达的LncRNA中，TINCR通过ERK1/2-SP3（特异性蛋白3）途径促进ALA-PDT诱导的细胞凋亡和自噬［50］；LINC00520通过抑制EGFR和失活PI3KAKT信号通路来抑制cSCC的A431细胞的侵袭和迁移［51］。目前迹象表明，lncRNA作为cSCC生物标志物及治疗靶点有巨大潜力。

1.5 表观遗传学疗法与皮肤鳞状细胞癌 尽管手术切除是大部分cSCC患者的一线治疗方法，但是不适合于复发或转移的晚期患者，通过对cSCC致病机制的广泛研究，靶向治疗和免疫治疗为这类患者提供了希望，目前被认为是这类不能手术治疗患者的主要治疗方法。美国食品药品监督管理局（FDA）批准了靶向PD-1抗体（西米普利单抗、派姆单抗）等药物用于临床靶向免疫治疗晚期cSCC，并取得了一定的疗效，而阿维鲁单抗、CK-301等靶向PD-L1抗体药物也进入临床试验，这些药物通过阻断PD-L1与T细胞表面PD-1 结合，避免T细胞失活起抗肿瘤作用［52］。另外，不符合抗PD-1治疗条件或抗PD-1无效的患者可接受靶向EGFR的药物治疗，它们通过阻断Ras等下游信号通路来抗肿瘤生长［53］，如西妥昔单抗、厄洛替尼等药物已经先后完成二期临床试验。

基于表观遗传变化可以逆转的特性，表观遗传改变成为癌症治疗的主要候选靶点，逆转表观遗传改变恢复正常的表观基因组为开发有效的表观遗传治疗提供了机会。表观遗传治疗最早始于20世纪70年代末逆转DNA甲基化的试剂研发，专门针对表观基因组的药物，称为表观药物，经过对大量样本进行的表观遗传调节研究，表观药物大致分为两类：DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰酶抑制剂［54］。这两种抑制剂（DNMTi和HDACi）都会影响染色质结构和表观药物的可及性，开放的染色质比紧密的染色质更容易结合这些药物，从而增强了药物杀死癌细胞的效果［55］。

DNMTi是胞苷的改进形式，其作用方式是与所有具有生物活性的DNMTs的催化活性部位共价结合，进而抑制DNMTs的酶活性［56］。目前美国FDA批准了两种DNMTi：2004年批准的5-氮胞苷（5-Azacytidine）和2006年批准的地西他滨（Decitabine），它们在治疗血液系统恶性肿瘤显示出重要的临床益处，但是这些药物药代动力学较差，半衰期较短，因无法口服而难以给药，且长时间或大量使用可能产生胎儿畸形和男性生育力下降等副作用［57，58］。另外，以甲基转移酶为靶点仍然缺乏特异性，可能会导致整体基因组低甲基化。目前尚未检索到cSCC与DNMTi相关临床试验报道。

HDACs通过去除组蛋白中的乙酰基来建立抑制染色质的环境，而HDACi能够重建正常的组蛋白乙酰化模式。HDACi通过抑制血管生成、产生活性氧（ROS）、调节细胞周期、阻滞生长、促进凋亡和影响癌细胞分化等分子事件发挥抗癌作用［59］。HDACi分为五大类：短链脂肪酸类、环肽类、异羟肟酸类、苯甲酰胺类和杂化分子。FDA分别于2006年、2009年、2014年和2015年批准了伏立诺他（SAHA）、罗米地辛（Romodepsin）、贝利司他（Belinostat）和帕比司他（Panobinostat）等用于癌症治疗的强效HDACi药物［60］，许多具有HDACi活性的化合物在其他癌症中正在用于治疗或正在进行临床试验，目前研究显示这类药物常见的副作用通常较低，包括疲倦、恶心和呕吐等［58］。Joshi等人研究显示，人参皂苷20（R）-Rg3或shHDAC3处理使HDAC3下调会导致c-Jun乙酰化，进而抑制cSCC上皮间充质转，此外，他们还发现伏立诺他在高度免疫抑制的小鼠中抑制人异种移植表皮样cSCC的生长；曲古抑菌素A诱导SCC细胞产生不可逆的生长停滞，MS-275 显著降低小鼠的cSCC 肿瘤负荷［61］。这些研究表明，HDACi代表了一种有前途的cSCC新兴疗法。当表观遗传药物与其他表观遗传药物、化疗、免疫疗法或靶向药物联合使用时，可产生抗癌的协同反应。这种方法的目标是解除表观遗传沉默机制和癌细胞的重新编程［62］。虽然DNMTi和HDACi作为单一药物在癌症治疗中都是有效的，但在联合治疗方法中，这些抑制剂通过增强对不适当沉默的基因的上调而产生更强的抗肿瘤作用［63］。

2 结语

表观遗传学改变通过影响肿瘤遗传过程中的关键基因发挥作用，是一种将环境压力和基因表达联系起来的机制，可逆表现遗传修饰是肿瘤治疗干预的理想靶点，期待更多及更深入的研究为cSCC患者早期诊断及治疗选择提供理论依据。同时，为了避免cSCC患者对不敏感药物不必要的副作用，识别生物标记物的临床试验对准确预测有效药物具有重要意义。