实时荧光定量PCR技术在婴儿HIV感染早期诊断中的应用

杨朝军，董莉娟，陈会超，戴 洁，杨 敏，金晓媚，杨 莉，陈 敏

（云南省疾病预防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022）

感染HIV的母亲在妊娠、分娩或哺乳期间将HIV传给婴儿称为垂直传播或母婴传播。据世界卫生组织报告，如果不采取任何干预措施，艾滋病病毒的母婴传染率在15%～45%之间。如果在妊娠和哺乳期间尽早向母亲和婴儿提供抗逆转录病毒药物，就可以降低直至消除母婴传播风险。被感染的婴儿越早进入治疗，他的生存质量越好。常用的婴儿早期诊断方法为HIV核酸检测，而核酸的聚合酶链式反应（PCR）技术发展很快，目前，广泛应用的是实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR，qPCR）。为此，作者对该技术在婴儿早期诊断上的应用开展了研究。

1 对象与方法

1.1 对象 调查对象为大理州和德宏州的感染艾滋病病毒的产妇所生的婴儿。各级妇幼保健机构负责收集相关信息，产妇需要签署知情同意书，婴儿在出生后1天、7天、21天、42天和3个月分别由医务人员采血制备干血斑样品，通过快递寄到云南省疾病预防控制中心进行检测。

1.2 方法 ① 从干血斑样品（DBS）中提取细胞基因组DNA。试剂为德国QIAamp DNA Mini Kit，操作步骤如下：打孔器打下3个直径为6mm的干血斑，加入ATL缓冲液180µL，85℃水浴10 min；加入蛋白酶K 20µL，56℃水浴1小时；加入AL缓冲液210µL，70℃水浴10 min；加入无水乙醇200µL，混匀后转移至分离柱，6000g 离心1 min；加入AW1洗液500µL，6000g 离心1 min；加入AW2洗液500µL，30000g 离心3 min；最后，加入洗脱液AE 50µL，6000g 离心1 min，得到核酸样品。② 核酸样品的扩增和检测。试剂为广州海力特生物科技有限公司的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。操作方法严格按照试剂说明书执行，使用Applied BiosystemsTM7500 实时荧光定量 PCR 系统进行扩增和分析。③ 婴儿满42天的干血斑用罗氏 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 系统进行HIV-1 核酸定性检测。比较两种检测方法的准确性。

2 结果

2.1 HIV-1 DNA定量检测 2019年4月至2020年8月共对51例婴儿进行了采样，其中3例婴儿仅完成出生时的采样，3例婴儿完成3次采样，2例婴儿完成4次采样，43例婴儿完成5次采样。共获得235份干血斑样品，采集情况见表1。经HIV-1 DNA定量检测，检测结果低于检测限。

表1 51例送检婴儿的干血斑采集情况统计

2.2 HIV-1 DNA定性检测 45例婴儿完成出生后42天干血斑的采集，用罗氏 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 系统进行HIV-1 DNA定性检测，检测结果低于检测限。

2.3 用本实验室2012年采集的21例感染HIV的婴儿的干血斑样品进行荧光定量PCR检测，婴儿的采血时间为出生后1个月至15个月不等［1］，结果全部为HIV-1DNA 阳性，循环阈值（Cycle threshold，Ct）在14和23之 间，DNA的 平 均 值 为4428 copies/1×106cells（41-31157），详见表2。

表2 21例感染婴儿的荧光定量PCR检测结果

2.4 实时荧光定量PCR技术对干血斑的检测结果 对51例送检婴儿的干血斑共235个样品进行实时荧光定量PCR检测，结果均低于试剂盒最低检测限；对21例已知感染婴儿的干血斑检测结果全部为阳性，该方法的敏感性和特异性均为100%。

3 讨论

由于暴露婴儿体内会携带来自母亲的HIV抗体，该抗体最长在婴儿满18个月才会消失，所以，抗体检测被各种早期诊断策略所替代。婴儿早期诊断（Early infant diagnosis，EID）采用核酸检测的方法，《全国艾滋病检测技术规范》（2015年修订版）要求在婴儿出生后6周及3个月进行核酸检测［2］。随着相关研究的进展，发现及早治疗可以减小病毒库，因此在婴儿早期诊断方面也在积极探索出生后及时进行核酸检测，出生时核酸检测结果为阴性就可以排除宫内感染。如果发生产时感染，需要在6周龄时再做核酸检测［3］。本研究尝试了在出生时和出生后7天和21天就进行采样检测，并使用高灵敏度的实时荧光PCR技术进行DNA定量检测，探索提早检测的方法和策略。由于在研究期间，项目地区未发生母婴传播的个案，所有研究对象均检测为阴性，并且与42天的定性检测结果相一致，因此，新技术的应用可以更早地排除感染，包括喂养过程中的感染。根据相关研究的进展，《全国艾滋病检测技术规范》（2020年修订版）也将首次采血的时间提早到出生后48小时内。如果核酸检测阳性，尽快再次进行检测，两次检测均阳性，就可以报告HIV核酸阳性。

婴儿早期诊断使用的是干血斑样本，该样本没有传染性，可以室温保存和运输，便于传递到区域中心实验室开展核酸检测。本研究先提取HIV-1DNA，再进行实时荧光定量PCR检测，检测下限为20 copies/1×106cells。以罗氏人类免疫缺陷病毒（1型）核酸检测试剂（罗氏V2.0）的结果为参考标准［4］，广州海力特人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA定量检测试剂的特异性为100%（235/235）；以婴儿满18个月HIV抗体的检测结果为标准，广州海力特试剂的敏感性为100%（21/21）。

实时荧光定量PCR技术检测暴露婴儿的干血斑样本，具有较高的敏感性和特异性，在婴儿早期诊断领域具有发展潜力［5］，为我国实施暴露婴儿早期诊断的策略提供了一项技术性的支持。