基于叶绿体DNA序列的多基原黄精分子鉴定

丛悦，李莉，张金霞，关佳莉，拱健婷，王大仟，赵艺萌

北京市临床药学研究所，北京 100035

黄精属（Polygonatum）是百合科（Liliaceae）多年生草本植物，该属植物种类繁多，全世界分布约60 个种，我国有39 个种，其中黄精Polygonatum sibiricumRed.、多花黄精P.cyrtonemaHua.和滇黄精P.kingianumColl.et Hemsl.是《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版中规定黄精药材的基原植物[1]，此外另有20 余种该属植物可在不同的地区入药。《中国药典》2020 年版规定的3 种黄精基原分布广泛，没有十分明显的地域性，地理分布区有重叠。近年来，通过引种栽培也人为地扩大了黄精的生长区域，增加了各类群间性状交叉和种质混杂。

黄精味甘，性平，具有健脾、滋阴和润肺等功能，其含有的主要化学成分包括多糖、甾体皂苷、黄酮、氨基酸等生物活性物质，具有提高免疫力、调血脂、降血糖、抗病毒、抗衰老和抑菌等广泛的药理活性，并具有食用价值[2-3]。不同基原黄精的药效物质基础有较大的差异，何俊婷等[4]对3 种基原黄精中多糖含量测定发现，多花黄精中多糖含量最高，其次是滇黄精和黄精。药效成分差异亦导致药理作用、开发利用等方面的不同，因此对黄精基原的鉴别具有重要意义。母系遗传的叶绿体matK、psbAtrnH、rbcL等基因由于进化速度快，引物通用性好等特点，常被应用于中药材分子鉴定。杨培等[5]评价了叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH序列，核内转录间隔区2（ITS2）和ITS 序列对黄精属植物的鉴定能力，结果表明，由于鉴定效率低，这些候选条形码序列均不适合该属植物的鉴定。Rpl20-rps12序列是叶绿体50S大亚基中编码基因L20与核糖体蛋白编码基因S12之间的基因间隔区序列，具有较髙进化速率，能提供丰富的信息位点，常用来解决在属下种间及近缘属间的系统发育关系[6]。叶绿体DNA（cpDNA）trnL-trnF序列在进化上具有选择压力小和进化速率较快的特点，已广泛应用于苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物科间、属间或种间亲缘关系及种内谱系地理学研究[7]。本研究收集来自辽宁、陕西、山西、浙江、广西、云南的3 种不同基原黄精，以药用部位根状茎为DNA 提取材料，比较分析rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列的分子特点和变异情况，为黄精基原鉴定提供分子依据。

1 材料

1.1 样品

本研究所用23份样品包括黄精10份、多花黄精8 份、滇黄精5 份，均为根状茎。采自辽宁、山西、陕西、浙江、广西、云南。样品由北京市中药研究所李莉研究员鉴定，凭证标本保存于北京市中药研究所（表1）。

表1 3种基原黄精采集信息

1.2 仪器与试剂

AB135-S 型分析天平（Mettler 公司）；Milli Q Biocel型纯水仪（Millipore公司）；3K15型通用台式冷冻离心机（Sigma 公司）；HWS-28 型电热恒温水浴锅（皓庄仪器有限公司）；EasyCycler 型聚合酶链式反应（PCR）仪（Analytik Jena 公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；C150 型凝胶成像系统（Azure Biosystems公司）。

多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；超强高保真PCR试剂盒（天根生化科技有限公司）；rpl20-rps12引物（正向：5′-TTTGTTCTACGTCTCCGAGC-3′，反 向：5′-GTCGAGGAACATGTACTAGG-3′）、trnL-trnF引物（正向：5′-GGTTCAAGTCCCTCTATCCCC-3′，反 向：5′ -ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′）、psbA-trnH引物（正向：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，反向：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′）[8]均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 基因组总DNA提取

分别取根状茎材料0.1 g放入预冷的研钵中，加液氮充分研磨成细粉。采用多糖多酚植物基因组DNA 提取试剂盒进行总DNA 提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取结果，分光光度计测DNA 的浓度和纯度。

2.2 PCR扩增及测序

通过设定温度梯度确定各序列片段最佳退火温度，rpl20-rps12为54 ℃，trnL-trnF为56 ℃，psbAtrnH为55 ℃。参照超强高保真试剂盒说明，PCR 扩增反应在25 μL 体系中完成，反应体系：灭菌双蒸水（ddH2O）10.2 μL，2×Ultra HiFi Mix 15 μL，引物各2.5 μmol·L-1，DNA 模板20 ng。扩增程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸15 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示为单一明亮扩增条带，PCR 产物由上海生工生物工程有限公司双向测序。

2.3 序列分析及数据处理

测序峰图使用ContingExpress软件进行正反比对并手工校正，经ClustalX 1.81[9]比对排列，去除前后两端低质量区。MEGA 5[10]软件以K2-P（Kimura 2-parameter）模型计算不同种间和种内遗传距离，每个物种内所有样本的K2-P距离即为种内遗传距离，3种基原黄精的K2-P距离即为种间遗传距离。1000次重复自展程序进行标准误检测，采用邻接（NJ）系统聚类树构建基于K2-P距离的群体聚类图。

3 结果

3.1 叶绿体基因的序列特征

共扩增23 份材料的3 个cpDNA 基因序列（rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH）69 条，均获得单一、清晰、明亮的特异性条带，PCR 扩增率和测序成功率均为100%，凝胶电泳结果见图1。采用MEGA 5 软件计算序列长度、鸟嘌呤+胞嘧啶（G+C）占比、碱基变异数、简约信息位点个数和序列插入/缺失情况，见表2。所测样品rpl20-rps12序列长度为722～737 bp，有3 个变异位点，平均G+C 占比为34.0%，简约信息位点3 个，占比0.4%，3 处存在1～9 bp 插入/缺失位点。所测样品的trnL-trnF的序列长度为293 bp。共3 个变异位点，平均G+C 占比为31.5%，简约信息位点3个，占比1%，无插入/缺失位点。所测样品的psbA-trnH的序列长度为457～531 bp，共11 个变异位点，平均G+C 占比为34.1%，简约信息位点有11个，占比2.4%，在97 bp处有1个长度为74 bp的插入/缺失位点。

表2 黄精3个叶绿体DNA序列基本特征

图1 黄精样品PCR扩增产物条带

3.2 种间和种内遗传距离分析

23 份黄精样品进行种间及种内遗传距离分析，结果见表3。rpl20-rps12序列3 个物种的种间距离均为0.002 7 bp，每个物种的种内遗传距离均为0。trnL-trnF序列种间遗传距离差异最大，多花黄精和滇黄精之间有最大遗传距离0.008 9 bp，黄精和滇黄精遗传距离最小，为0.003 3 bp。黄精和滇黄精的种内遗传距离为0，多花黄精的种内遗传距离为0～0.003 8 bp。psbA-trnH序列种间最大遗传距离是黄精和滇黄精之间，为0.022 2 bp，黄精和多花黄精的种间遗传距离最小为0.002 4 bp。黄精和滇黄精的种内遗传距离为0，多花黄精的种内遗传距离为0～0.001 8 bp。

表3 3种基原黄精K2-P遗传距离bp

3.3 聚类分析

使用MEGA 5 软件构建NJ 系统发育树，结果见图2。rpl20-rps12序列可将黄精、多花黄精和滇黄精完全分开，支持率分别为64%、65%和62%。trnL-trnF序列鉴别黄精、多花黄精和滇黄精的支持率分别为66%、66%和63%，同样具有较好的鉴别能力，广西桂林多花黄精与辽宁、浙江多花黄精有较远的遗传距离，独立聚为1 支。psbA-trnH序列也有很好的鉴别能力，对黄精、多花黄精和滇黄精的支持率分别为63%、67%和100%。

图2 基于不同叶绿体DNA序列的黄精样品NJ树

4 讨论

对《中国药典》2020 年版规定的3 种基原黄精化学研究显示，基原和产地的差异会导致多糖、黄酮、皂苷类主要活性成分含量不同[11-12]，这些药效物质基础的差异会对临床精准用药、中成药质量评价及功能性产品开发等造成影响，因此准确的基原鉴定是评价药材质量和合理应用的根本保证。本研究收集了6 个省份3 种基原黄精共23 份，采用cpDNA非编码区rpl20-rps12、trnL-trnF和psbA-trnH序列探索3种基原黄精的分子鉴定方法。3个序列的长度在800 bp 以内，PCR 扩增率和测序成功率为100%，表明3 个片段均有良好的引物通用性。从序列长度、变异位点及简约信息位点综合来看，psbA-trnH序列的变异性最大（2.4%），其次是trnL-trnF序列（1.0%），rpl20-rps12较为保守，信息位点数占比仅为0.4%。理想的条形码序列需具有明显的种间变异、足够小的种内变异，种间最小变异要远大于种内最大变异[13]。本研究的3条序列中，rpl20-rps12和psbA-trnH序列种间最小遗传距离均大于种内遗传距离，种内和种间遗传距离之间不存在重叠区域；trnL-trnF序列最小种间距离为0.003 3 bp 与最大种内距离0.003 8 bp 相近，遗传距离略有重叠。采用标准的分子系统学方法构建系统聚类树是鉴定物种最常用的方法[14]，若同一个物种的不同个体在分子系统树上形成单系，并且单系支持率＞50%，则认为物种能够被识别。采用NJ 法对23 个样品进行聚类，研究发现rpl20-rps12、trnL-trnF和psbA-trnH都可将3种基原黄精聚成单系，且支持率＞50%。

尽管psbA-trnH被认为是被子植物中进化速率最快的叶绿体间隔区之一，是药用植物鉴定推荐的条形码[15]。然而有研究发现，某些物种间psbA-trnH基因间隔区存在插入缺失，长度变异较大，不利于序列比对，存在的倒位现象也会引起对遗传多样性的过度评估[16-17]。本研究中扩增3 种黄精cpDNApsbAtrnH片段，发现存在一处74 bp插入缺失，这种较大的长度变异增加了序列对比难度，也使得该片段难以用于非同属物种间的鉴定。相比之下，rpl20-rps12和trnL-trnF序列相对保守，rpl20-rps12存在3 处较小片段（1～9 bp）插入/缺失。trnL-trnF片段较短，没有插入/缺失，但种内和种间遗传距离之间略有重叠。通过NJ 聚类分析判定鉴定效果，3 个片段都可将3 个种的黄精鉴别开来，但从引物通用性、序列特点和种内、种间变异性综合来看，rpl20-rps12序列更适宜。另已有研究显示，rpl20-rps12片段可鉴别宁夏枸杞和枸杞，但未能鉴别其他枸杞属植物[18]，因此rpl20-rps12序列是否能应用到更多种黄精属植物鉴别，还需更深入的分子研究。