高浓度CO2对2株生防真菌生长与致病力的影响

王从林，刁红亮，邢培翔，王 迪，王志鑫，马瑞燕

（1.山西农业大学植物保护学院 山西 太谷 030801；2.山西农业大学农学院 山西 太谷 030801）

工业革命之后，全球大气中的CO2浓度一直处于上升状态，目前大气CO2浓度已达到400 μmol/mol，预计2100 年将上升至730～1 020 μmol/mol。升高的CO2浓度除了对全球气候的变化产生重大影响之外，还对各种植物、昆虫以及微生物的生长和活动等都有不同程度的影响[1-2]。环境中CO2浓度的增加可加大植物分支和分蘖的机会以及促进根系和幼苗的生长，促进水分的利用，加快植物自身循环代谢积累和生长，提高植物的抗逆境和光合等作用[3]。与此同时，发展富碳农业也逐渐成为各国应对气候变化和粮食安全的重要举措。富碳农业是以高于大气中二氧化碳浓度作为气肥释放在相对密闭的人造气候的小区域中，培养种植各类作物，辅以其他科学技术手段，创造一个高效率的光合作用环境，生产出大量农业产品的一类农业生产新技术[4]，其中以富碳温室的应用最为普遍。富碳温室的出现解决了作物光合作用活动加强时CO2浓度降低引起的CO“2饥饿症”，进而影响作物产量和品质的问题。有研究表明，在黄瓜棚中适量增加CO2浓度后，平均叶宽和叶长会增加1.0～1.3 cm，平均株高、平均茎围以及平均挂果数都有显著增加，增施CO2也可促进作物提前成熟，改善蔬菜品质，使作物根系更发达等[5]。赵静等[6]研究发现，高浓度CO2加快了草莓果实的生长，提高了产量，改善了果实品质。因此，对C3植物来说，CO2浓度升高具有显著的“CO2施肥效应”，而现有CO2条件下其光合速率受到限制，其最适CO2浓度约为1 000 μmol/mol[7]。

另一方面，CO2浓度升高也会对农业生态系统产生一些负面影响[8]。王璐等[9]研究发现，CO2浓度升高使甜椒光合作用和水分利用率升高，促进了其生长发育，但同时也使甜椒蚜虫数总量显著增加97.30%，整体虫害发生加剧，导致其产量及地上部生物量无显著变化。因此，关注富碳环境下病虫害的安全高效治理是保障富碳农业可持续发展的必要举措。昆虫病原真菌可与节肢动物形成一种有利于自身但有害于寄主的共生关系，是一种寄生性真菌，其中一些可用于虫害防治的又被称作生防真菌[10]。生防真菌在昆虫纲（Insecta）和蜱螨目（Acarina）中具有较广的寄主范围和显著的应用特点，是目前唯一可高效防治半翅目刺吸式口器害虫的生防资源[11]。以虫生真菌为活性物的真菌杀虫剂已被广泛应用于温室、大田和园林中的蓟马、白粉虱、蚜虫等主要害虫的防治[12]，是一种安全高效的生物防治技术。玉米粘虫（Mythimna separateWalker），又名东方粘虫，属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），喜食稻、麦、粟、黍、玉米、高粱等作物，是严重威胁我国粮食生产安全的重大虫害[13]。温室白粉虱（Trialeurodes vaporariorumWestwood）属同翅目（Homoptera）粉虱科（Aleyrodidae），繁殖力强，食性杂，是温室蔬菜的主要害虫之一[14]。

本试验以2 株重要的生防真菌玫烟色棒束孢（Isaria fumosoroseaWize）和白僵菌（Beauveria bassianaVuill）为对象，研究了富碳条件对菌株孢子萌发能力和对玉米粘虫和白粉虱2 种寄主害虫致病力的影响，并进一步研究了高浓度CO2条件对2 个菌株萌发与生长的影响，旨在为富碳温室中应用生防真菌防治虫害提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 玫烟色棒束孢IF-1106 菌株（简称IF-1106），分离自山西省晋中市太谷县普通温室大棚中，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.7514。

白僵菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC 41021（简称BB-1021），为冻干菌种，经打管活化后再转接2～3 代恢复菌种活力后使用。

1.1.2 供试昆虫 温室白粉虱（Trialeurodes vaporariorumWestwood）为山西农业大学植物保护学院昆虫实验室稳定培养种群，饲养与繁殖条件为温度为（26±1）℃，湿度65%±5%，光照L∶D＝14∶10。

玉米粘虫（Mythimna separateWalker）为山西农业大学植物保护学院制药工程实验室稳定培养种群，饲养与繁殖条件为温度（25±1）℃，湿度60%～80%，光照L∶D＝12∶12。

1.2 试验方法

1.2.1 生防真菌孢子悬浮液的配制 将2 株生防菌株接种于PDA 培养基进行培养，培养条件为25℃、12∶12（L∶D），培养10 d产孢。将一定量0.1%吐温-80无菌水加入到长满菌丝的培养皿中，用刮板轻轻将孢子和菌丝刮下，将孢子混合液转移至盛有玻璃珠的锥形瓶中，将孢子均匀打散，用灭菌纱布过滤得到母液。先用血球计数板调整母液至孢子浓度为1.0×108个/mL，再将其稀释相应浓度。

1.2.2 生防真菌孢子萌发率的测定 采用改进后COHEN 等[15]的CFU 孢子萌发率方法测定菌株的孢子萌发率。使用无菌移液器吸取200 μL配制好的孢子悬浮液（浓度为1.5×103个/mL）置于直径为150 mm PDA平板中（每皿约含300个孢子），以无菌涂布器涂布均匀。将接种后的平板分别置于25 ℃的普通霉菌培养箱和富含CO2培养箱中，培养48～72 h直至生长出清晰菌落，使用菌落计数器确定平板中的菌落数，并计算孢子萌发率。富碳条件的CO2质量分数为1 000 mg/kg（0.1%），高体积分数CO2条件分别设定为5%、10%、15%和20%，普通条件下CO2质量分数约为400 mg/kg（0.04%）为对照，每个处理设5个重复。

1.2.3 生防真菌生长速率的测定 首先将直径6 mm 的灭菌滤纸片置于PDA 平板中央，以无菌移液器吸取2.5 μL 孢子悬浮液（1.0×107个/mL）轻轻接种在滤纸片上，将接种后的平板置于25 ℃的CO2培养箱培养。培养72 h 后取出平板采用十字交叉法测定菌落直径，连续测定10 d。

1.2.4 生防真菌致病力测定 分别配制3 个浓度的孢子悬浮液（1.0×106、1.0×107和1.0×108个/mL），对玉米粘虫3龄幼虫进行浸渍感染。浸渍20 s后放入培养皿中并用保鲜膜封口，在薄膜上扎小孔通气，置于25 ℃、12 L∶12 D、相对湿度80%以上CO2人工气候箱培养。每天更换新鲜玉米叶，每日检查死亡虫数，根据虫尸体表长出的真菌孢子确定为感染致死，连续观察7 d。每个处理设6 个重复，每个重复15头试虫，以0.01%吐温-80的无菌水处理作为空白对照。

用同上所述的3 个浓度的孢子悬浮液对带有白粉虱2龄若虫的黄瓜叶片进行喷雾侵染，直至叶片上形成液滴并自然滴下，用0.1%的吐温-80 无菌水处理作为对照。每处理设6个重复，每个重复中含2龄若虫50头。待黄瓜叶片自然晾干后，将幼苗置于25 ℃、14 L∶10 D、相对湿度80%以上的CO2人工气候箱中，在富碳条件（CO2质量分数1 000 mg/kg）和普通条件（CO2质量分数400 mg/kg）下培养，并逐日观察记录白粉虱致死情况，连续观察7 d。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0 数据处理系统对生防真菌的萌发与生长进行统计分析，计算平均值和标准误，萌发率通过Duncan新复极差法进行显著性分析（P＜0.05）。回归方程用SPSS 19.0 线性回归分析得出，回归方程斜率即为菌落生长速率。

生防真菌在不同CO2条件下对试虫的累计校正死亡率采用Duncan多重比较法进行显著性分析（P＜0.05）。生防菌株的致病力数据均采用SPSS 19.0软件处理。

2 结果与分析

2.1 富碳条件对2株生防真菌萌发率的影响

2株生防真菌在富碳条件与普通条件下的萌发率对比结果如图1 所示。从图1 可以看出，生防菌株IF-1106 在富碳条件与普通条件下的孢子萌发率（F＝0.079；df＝1，8；P＝0.785）差异不显著；而生防菌株BB-1021 在富碳条件与普通条件下的孢子萌发率（F＝0.087；df＝1，8；P＝0.776）同样差异不显著。表明富碳温室中的高CO2浓度环境对2株生防真菌的萌发没有影响。

2.2 高体积分数CO2对2株生防真菌萌发率的影响

在CO2体积分数为5%、10%、15%、20%时，2株菌株的萌发率分别如图2、3 所示。由图2 可知，在不同体积分数CO2条件下，IF-1106 孢子萌发率存在显著差异（F＝94.050；df＝4，24；P＜0.001），其中当CO2体积分数为10%时，菌株的萌发率最高，为96.68%±3.29%，且与对照差异不显著（P＝0.964）；当CO2体积分数为5%和15%时，孢子萌发率分别为69.08%±3.11%和65.44%±1.64%；当CO2体积分数为20%时，孢子萌发率最低，为19.48%±3.44%。结果表明，在CO2体积分数为10%时，IF1106 菌株孢子的萌发无抑制作用。

由图3 可知，不同浓度CO2对BB-1021 的孢子萌发率也存在显著的差异（F＝120.64；df＝4，24；P＜0.001）。其中，当CO2体积分数为5%和10%时，孢子萌发率均为100%，且显著高于对照（P＝0.015；P＝0.040）；当CO2体积分数为15%和20%时，菌株的萌发率分别为79.73%±2.02%和61.60%±2.09%，且显著低于对照（P＜0.05）。表明CO2体积分数为5%和10%对BB-1021 菌株孢子的萌发无抑制作用。

2.3 高体积分数CO2对2株生防菌株生长的影响

在CO2体积分数为5%、10%、15%、20%时，2个菌株菌落的生长拟合曲线分别如图4、5所示，其生长速率回归方程及其参数如表1、2所示。从图4和表1可以看出，不同体积分数CO2条件对IF-1106菌株菌落的生长有一定影响。当CO2体积分数为5%、10%和15%时，对2 个菌株菌落的生长具有一定促进作用，其中CO2体积分数为10%时，菌株的生长速率显著最大（P＜0.05），达到3.019 mm/d；当CO2体积分数为5%和15%时，菌株的生长速率较对照差异不显著；当CO2体积分数为20%时，2个菌株菌落的生长速率为2.505 mm/d，显著低于对照（P＜0.05）。

表1 玫烟色棒束孢的生IF-长1速10率6在回不归同方体程积分数CO2条件下Tab.1 Growth rate regression equation of Isaria fumosorosea IF-1106 at different CO2 concentrations

从图5 和表2 可以看出，不同体积分数CO2对BB-1021菌株菌落的生长也有一定影响。当CO2体积分数为5%、10%和15%时，对菌落的生长具有显著的促进作用（P＜0.05），其中CO2体积分数为5%时菌株的生长速率最大，达到（3.398±0.055）mm/d；当CO2体积分数为20%时，菌落的生长速率为（2.359±0.0317）mm/d，显著低于对照。

表2 白僵菌BB生-长10速21率在回不归同方浓程度CO2条件下的Tab.2 Growth rate regression equation of Beauveria bassiana BB-1021 at different CO2 concentrations

2.4 富碳条件对2株生防真菌致病力的影响

2.4.1 富碳条件对2株生防真菌感染玉米粘虫3龄幼虫致病力的影响 在普通环境（CO2质量分数400 mg/kg）和富碳环境（CO2质量分数1 000 mg/kg）中，用不同浓度的孢子悬浮液处理玉米粘虫3龄幼虫，7 d后的累计校正死亡率如图6所示。

从图6 可以看出，在2 种CO2浓度条件下，IF-1106菌株1.0×107个/mL和1.0×108个/mL这2个浓度孢子悬浮液对玉米粘虫3 龄幼虫的感染死亡率与对照存在显著性差异（P＜0.05）。当浓度为1.0×106个/mL 时，2 种CO2条件下的校正死亡率差异不显著（F＝0.078；df＝1，8；P＝0.788）；当浓度为1.0×107个/mL 和1.0×108个/mL 时2 种CO2条件下的校正死亡率差异显著（（F＝16.010；df＝1，8；P＝0.004），（F＝10.021；df＝1，8；P＝0.013）），且富碳环境下IF-1106菌株对粘虫3龄幼虫的感染致死能力显著高于普通环境。

BB-1021菌株在浓度为1.0×106个/mL时，2种CO2浓度条件下的校正死亡率差异显著（F＝28.048；df＝1，8；P＝0.001）；当浓度1.0×107个/mL 和1.0×108个/mL时，校正死亡率差异均不显著（（F＝2.208；df＝1，8；P＝0.176）；（F＝0.186；df＝1，8；P＝0.677））。在富碳环境下BB-1021菌株1.0×106个/mL浓度感染致死能力显著高于普通环境。

2.4.2 富碳条件对2 株生防真菌感染温室白粉虱2 龄若虫致病力的影响 用不同浓度的IF-1106和BB-1021 分别在普通环境和富碳环境中感染温室白粉虱2 龄若虫，7 d 后累计校正死亡率如图7所示。

从图7 可以看出，2 种CO2浓度条件下IF-1106孢子悬浮液对白粉虱2 龄若虫的感染死亡率差异均不显著（（F＝0.002；df＝1，8；P＝0.965）；（F＝3.821；df＝1，8；P＝0.086）；（F＝0.094；df＝1，8；P＝0.768））。

BB-1021 菌株各个浓度孢子悬浮液对白粉虱2 龄若虫的感染死亡率差异均不显著（（F＝0.051；df＝1，8；P＝0.827）；（F＝0.899；df＝1，8；P＝0.371）；（F＝1.355；df＝1，8；P＝0.278））。

3 结论与讨论

近年来，CO2浓度升高对微生物群落和生长的影响已成为研究热点，但多集中于对土壤微生物的研究，鲜有涉及昆虫病原真菌。一般认为，CO2浓度升高促进了碳输入，对真菌的生长更为有利[16]，例如土壤功能微生物丛枝菌根真菌丰富度在CO2浓度升高下平均增加了21%[17]。本研究结果显示，CO2浓度提高到富碳温室水平时，生防真菌玫烟色棒束孢IF-1106 和白僵菌BB-1021 的孢子萌发没有受到影响，可以保持正常的萌发率。当CO2体积分数提高至10%时，玫烟色棒束孢IF-1106孢子萌发无显著影响并且菌丝生长速率明显提高；当CO2体积分数为5%时，白僵菌BB-1021 孢子萌发无显著影响且菌丝生长速率显著增加。结果表明，一定体积分数的CO2可在不影响孢子萌发的前提下促进菌株的菌落生长，这种响应特点应该与菌株生长萌发的需氧量特性有关，例如，玫烟色棒束孢属于发酵培养需氧量较低的虫生真菌[18]，但其具体机制还有待进一步明确。而过高的CO2浓度开始影响到菌株的正常呼吸作用，因此，当试验中CO2体积分数≥15%时，菌株的萌发生长被明显抑制。

玫烟色棒束孢和白僵菌可有效感染温室白粉虱。孟豪[19]测定了玫烟色棒束孢和白僵菌对温室白粉虱2龄若虫的致病力，其LC50值分别为1.58×105、3.57×106个/mL。NAEEM 等[20]研究发现，玫烟色棒束孢和白僵菌也可有效感染玉米粘虫，对玉米粘虫3龄幼虫的LC50值分别为3.19×108、6.48×108个/mL。提高CO2的浓度对昆虫和微生物都会产生一定影响，因此，在富碳条件下生防真菌的致病力可能是交互作用影响的结果。林春燕等[21]研究发现，高浓度CO2对II 型豌豆蚜产蚜前历期无明显影响，但能显著抑制其繁殖力。CO2浓度的升高会引起自然界各个组分的改变，使昆虫的生存环境和竞争者发生改变，从而间接影响昆虫生长发育的过程以及生活习性[22-23]。赵磊[24]研究发现，CO2浓度升高对亚洲玉米螟的生长发育、取食效应、种群特性都产生了显著影响。本研究对比了富碳条件与普通条件下生防真菌玫烟色棒束孢和白僵菌对2 种害虫的致死率，结果显示，富碳条件对2株生防真菌感染2种害虫的致死率无显著影响并具有一定促进作用，这表明在富碳条件下可以使用这2 株生防真菌作为害虫防治因子。

本研究表明，富碳温室中的高CO2浓度环境对生防真菌玫烟色棒束孢和白僵菌的萌发没有影响，同时也对菌株侵染玉米粘虫和温室白粉虱的致病力没有显著影响。当CO2体积分数小于10%时，白僵菌孢子的萌发不受到抑制，玫烟色棒束孢孢子的萌发受到轻微抑制；当CO2体积分数大于10%时，对2株菌株的孢子萌发均有较强的抑制作用，表明10%的CO2体积分数可能是2株病原真菌孢子萌发的临界值。同时，白僵菌较玫烟色虫草对高体积分数的CO2表现出更高的耐受性。当CO2体积分数为20%时，3株生防真菌的菌丝生长均受到了抑制，表明15%～20%的CO2体积分数可能是2株真菌菌丝生长的临界值。张鑫等[25]研究表明，高浓度CO2会降低黏虫体内甘油三脂含量及体质量，使水分含量增大，这有利于昆虫病原真菌在侵染寄主时，需要一定的湿度，在寄主体内需要吸收寄主营养和水分，来满足自身的生长。因此，高体积分数CO2对真菌的生长提供了更加合适的环境，粘虫的死亡率相应增加。本研究表明，富碳温室的高浓度CO2环境不影响2株生防真菌的萌发，支持了以生防真菌作为富碳温室的生防因子防治温室虫害的可行性，且进一步明确了一定的高浓度CO2条件可在不影响孢子萌发的前提下有效促进生防真菌的生长。