壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒仔猪盲肠形态、微生物组成、代谢产物以及炎症反应的影响

侯国珺,张民扬,汪晶,朱伟云

(南京农业大学动物科技学院/国家动物消化道营养国际联合研究中心/动物科学类国家级实验教学示范中心,江苏 南京 210095)

早期断奶使仔猪从母乳中获得的被动免疫逐渐丧失,容易受到致病菌的感染,从而易引发仔猪腹泻[1]。在这一时期通过饮食干预有助于缓解仔猪的断奶应激。本课题组研制的壳聚糖螯合锌由壳聚糖与无机锌螯合而成。本课题组前期研究表明,壳聚糖螯合锌可以改善断奶仔猪小肠的形态结构,提高抗氧化及屏障功能,降低断奶仔猪腹泻发生率[2]。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物,是自然界中一种碱性多糖[3]。由于壳聚糖可以缓解机体的氧化损伤,提高免疫功能,且有很好的抑菌效果,故作为饲料添加剂广泛应用于动物生产中[4]。锌作为机体必需的一种微量元素,参与体内多种酶的合成。锌具有增强上皮细胞屏障,调节微生物组成及促进肠道发育等功能[5]。在日粮中添加无机锌有助于仔猪的生长发育,降低腹泻率,但是较高浓度的锌离子会产生细胞毒性。连续添加药理剂量(2 000～3 000 mg·kg-1Zn)的氧化锌21 d后其毒性就会表现出来,包括仔猪平均日增重降低,肠道中沙门氏菌增多,肠黏膜产生炎症反应等[6-7]。此外,高剂量的无机锌被动物摄入后,大约80%不会被动物利用,而是排出体外导致环境污染和锌源浪费。因此,寻找绿色高效的无机锌替代品十分必要。壳聚糖作为一种络合剂,通过氮、氧或它们的组合与机体正常生长所需的金属离子结合后,可能留下一些潜在的供体原子,这些供体原子增强了生物学活性,比如使螯合物具有更强的抗菌性能[8]。然而,壳聚糖螯合锌对于盲肠的作用却不清楚。盲肠作为大肠的一部分,是微生物聚集和发酵的重要场所。微生物利用肠道中的底物发酵生成一些有益的代谢产物,有助于改善肠道屏障、调节免疫应答及抑制病原菌增殖,对仔猪的生长发育十分重要[9]。因此,本试验选用盲肠作为研究对象,探究壳聚糖螯合锌对断奶仔猪盲肠形态、菌群组成、代谢产物以及黏膜炎症反应的影响,旨在为纳米壳聚糖螯合锌在断奶仔猪生产中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用壳聚糖螯合锌(直径50～150 nm)是由本课题组制备的一种分别含质量分数为5%～10%的锌和50%～60%壳聚糖的配合物(专利号:201910039700.4),所用壳聚糖(CS)脱乙酰度大于95%,相对分子质量80 000～90 000,购于海得贝海洋生物工程有限公司。氧化锌(ZnO)购于中国医药集团。

1.2 试验动物与试验设计

选取48头21日龄的“杜长大”(杜洛克×长白猪×大约克夏)断奶仔猪,初始体重平均为6.21 kg。将仔猪随机分为4组,每组4个重复,每个重复3头。具体分组为对照组(CON)、氧化锌组(ZnO)、壳聚糖螯合锌组(CS-Zn)和壳聚糖组(CS)。对照组饲喂基础日粮;氧化锌组在基础日粮中添加锌含量为1 600 mg·kg-1的氧化锌;壳聚糖螯合锌组在基础日粮中添加壳聚糖螯合锌,其中锌含量为100 mg·kg-1,壳聚糖含量为766 mg·kg-1;壳聚糖组在基础日粮中添加766 mg·kg-1壳聚糖。试验期间,仔猪不使用抗生素,自由采食和饮水。于试验15 d时,每组随机选取6头仔猪(包含所有重复),每头口服含1010CFU的大肠杆菌K88培养液进行攻毒试验。攻毒后48 h,屠宰取样。将仔猪解剖分离盲肠,采集盲肠食糜,存于无菌冻存管中,保存在-80 ℃液氮中。用无菌载玻片刮取盲肠黏膜于冻存管中并置于液氮中保存。基础日粮配方参照NRC(2012)猪营养需要进行配制,饲粮组成及营养水平见表1。本试验在江苏省徐州市正大集团猪场进行,试验前对猪舍环境及器具进行消毒。试验期间严格遵守猪场饲养管理制度。

表1 基础日粮组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet %

1.3 测定指标及方法

1.3.1 盲肠形态学分析取出固定24 h后的盲肠组织,制作HE染色切片。主要步骤:先将固定的盲肠组织脱水,然后进行石蜡包埋,将包埋后的组织切成5 μm左右的切片,最后进行苏木精-伊红(HE)染色,制作HE染色切片。将制作好的切片在光学显微镜下观察盲肠的形态。每个切片选取至少6个视野清晰、结构完整的视野进行盲肠隐窝深度和黏膜厚度测定。参照Hayakawa等[10]的方法,对仔猪盲肠形态进行病理评分。

1.3.2 盲肠食糜微生物DNA的提取及16S rRNA的测序参照Zoetendal 等[11]所描述的bead-beating法,称取0.2 g的盲肠食糜并提取细菌总DNA,然后用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific Inc.,美国)检测DNA的浓度和纯度。当D260/D280为1.8～2.0,表明DNA相对较纯,符合试验要求。使用引物对338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增细菌16S rRNA基因的V3—V4区域。PCR程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,29个循环;72 ℃ 10 min。用20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,再用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences,美国)纯化PCR产物。最后,按照标准方案在Illumina HiSeq平台上对纯化的文库进行配对末端的高通量测序[12]。

1.3.3 盲肠食糜细菌代谢产物及pH值的测定参照Zhou等[13]的方法,使用气相色谱仪(Shimadzu GC-14A,日本岛津)测定盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的含量。使用乳酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定盲肠食糜中乳酸含量。采样过程中,收集盲肠食糜后立即用pH计测定盲肠食糜pH值。

1.3.4 盲肠黏膜细胞因子浓度测定从液氮中取出0.1 g盲肠黏膜,加入900 μL磷酸盐缓冲液(PBS),用匀浆机粉碎黏膜组织,然后4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min。取上清液,用ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定盲肠黏膜中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)、髓过氧化物酶(MPO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素 γ(IFN-γ)和转化生长因子β(TGF-β)含量。

1.4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠组织形态的影响

如图1所示:对照组仔猪盲肠形态异常,损伤较为严重;氧化锌组和壳聚糖组仔猪盲肠形态得到一定改善,表现为轻度或中度异常;而壳聚糖螯合锌组仔猪盲肠形态得到明显改善,黏膜结构完整,损伤较轻。此外,如表2所示:与对照组相比,氧化锌和壳聚糖螯合锌处理显著降低了仔猪盲肠隐窝深度(P<0.05)。盲肠病理评分结果显示,壳聚糖螯合锌组和壳聚糖组仔猪盲肠病理评分显著低于对照组(P<0.05)。

图1 盲肠组织切片的HE染色Fig.1 The HE staining of cecum slice CON:对照组(基础日粮)Control group(basal diet);ZnO:氧化锌组 Zinc oxide group(Zn 1 600 mg·kg-1);CS-Zn:壳聚糖螯合锌组Chitosan-chelated zinc group(CS 766 mg·kg-1,Zn 1 600 mg·kg-1);CS:壳聚糖组 Chitosan group(CS 766 mg·kg-1). 下同The same as follows.

表2 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠形态的影响Table 2 Effects of chitosan-chelated zinc on cecum morphology in weaned piglets challenged with Escherichia coli K88

2.2 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠微生物多样性的影响

16S rRNA测序长度为PE300,将测序得到的双端序列数据根据PE reads间的overlap关系,将成对的reads拼接成一条序列,同时对reads的质量和拼接效果进行质控过滤,根据序列首尾两端的条码和引物序列区分样品得到有效序列,并校正序列方向,得到优化后的有效序列1 411 779个,平均每个样本有效序列为58 824个。如表3所示:4组间的α多样性指数包括Shannon、Simpson、ACE和Chao指数均没有显著变化。基于bray-curtis距离进行盲肠微生物的主坐标分析(PCoA分析),并用ANOSIM进行组间差异检验,结果(图2)显示,4个不同处理组盲肠微生物显示出明显的聚类分开(P=0.028)。

表3 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠微生物多样性的影响Table 3 Effects of chitosan-chelated zinc on microbial diversity of cecum in weaned

图2 盲肠微生物的主坐标分析(PCoA分析)Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of cecum microbiota

2.3 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠微生物组成的影响

如图3-A所示:在盲肠食糜微生物门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门,占微生物总数的90%以上。如图3-B所示:与对照组相比,壳聚糖组和壳聚糖螯合锌组中仔猪盲肠变形菌门的相对丰度均显著降低(P<0.05)。

图3 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠微生物门水平(A)和变形菌门(B)的影响Fig.3 Effect of chitosan-chelated zinc on the phylum level(A)and Proteobacteria(B)of cecum microbiota in weaned piglets challenged with E.coli K88不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences at 0.05 level. The same belows.

如图4-A所示:在属水平上,将在所有样本中丰度比例大于1%的菌属进行归类,结果显示乳杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、普氏菌属9(Prevotella9)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、链球菌属(Streptococcus)是主要的优势菌属。如图4-B所示:与对照组相比,壳聚糖螯合锌组盲肠食糜中乳杆菌属和普氏菌属9的相对丰度显著提高(P<0.05),链球菌属和布劳特氏菌属(Blautia)的相对丰度显著降低。与氧化锌组相比,壳聚糖螯合锌组中链球菌属的相对丰度显著降低(P<0.05)。

图4 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠微生物属水平组成(A) 和主要菌属(B)的影响Fig.4 Effect of chitosan-chelated zinc on genus level composition(A)and main bacterial genus(B) of cecum microbiota in weaned piglets challenged with E.coli K88

2.4 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠内容物pH和微生物代谢产物的影响

如表4所示:与其他3组相比,壳聚糖螯合锌组仔猪的盲肠食糜pH值显著降低(P<0.05)。与对照组相比,壳聚糖螯合锌处理显著提高了盲肠食糜中乙酸、丁酸、总短链脂肪酸及乳酸的水平(P<0.05)。其中,丁酸、总短链脂肪酸和乳酸的浓度在壳聚糖螯合锌和壳聚糖组间无显著差异(P>0.05)。

表4 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠微生物代谢产物的影响Table 4 Effects of chitosan-chelated zinc on cecum microbial metabolites in weaned piglets

2.5 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠黏膜髓过氧化物酶和细胞因子水平的影响

如图5所示:与对照组相比,氧化锌组、壳聚糖螯合锌组以及壳聚糖组盲肠黏膜中髓过氧化物酶(MPO)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平均显著降低(P<0.05)。与氧化锌组和壳聚糖组相比,壳聚糖螯合锌组中IL-1β水平显著降低(P<0.05)。与其他3组相比,壳聚糖螯合锌组中干扰素γ(INF-γ)水平显著降低(P<0.05)。白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)在4组间没有显著差异(P>0.05)。

图5 壳聚糖螯合锌对大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪盲肠黏膜MPO和细胞因子水平的影响Fig.5 Effect of chitosan-chelated zinc on MPO and cytokines level in cecum mucosa of weaned piglets challenged with E.coli K88 MPO:髓过氧化物酶 Myeloperoxidase;IL-1β:白细胞介素1β Interleukin-1β;IL-10:白细胞介素10 Interleukin-10;TNF-α:肿瘤坏死因子α Tumour necrosis factor-α;IFN-γ:干扰素γ Interferon-γ;TGF-β:转化生长因子β Transforming growth factor-β.

3 讨论

在动物生产中,高剂量氧化锌的使用存在许多副作用。根据中华人民共和国农业农村部的规定,仔猪断奶后2周内饲料中锌的最高含量为 1 600 mg·kg-1。减少断奶仔猪饲料中锌的使用量是本试验的目的之一。为了探究CS-Zn是否能发挥与高剂量氧化锌类似的效果,替代高剂量氧化锌的使用,我们设置了锌含量为 1 600 mg·kg-1的ZnO组。有研究表明,断奶仔猪日粮中添加100 mg·kg-1纳米锌替代高剂量氧化锌具有较好的效果[14-15]。在日粮中添加壳聚糖螯合锌(锌含量100 mg·kg-1,非纳米颗粒形式)可以提高断奶仔猪的抗氧化能力和免疫功能[16],提供有益的抗凋亡作用和维持断奶仔猪的肠屏障功能以及黏膜免疫功能[17],降低断奶仔猪腹泻率和提高生长性能[18]。因此,本研究中,在日粮中添加锌含量为100 mg·kg-1的纳米壳聚糖螯合锌(CS-Zn),以研究CS-Zn对高剂量氧化锌的替代效果。此外,根据CS-Zn生产工艺,在日粮中添加CS-Zn使锌含量为100 mg·kg-1,此时日粮中壳聚糖的含量为766 mg·kg-1。早期断奶容易诱发仔猪断奶应激综合征,导致腹泻。我们之前的研究发现,在饲粮中添加壳聚糖螯合锌可以改善大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪的生长性能,降低腹泻的发生率[2],此外在大鼠试验中,也证明了壳聚糖螯合锌可以改善大肠杆菌攻毒大鼠的肠道微生物组成和肠道功能[19-20]。因此,我们利用大肠杆菌K88攻毒的断奶仔猪腹泻模型,研究壳聚糖螯合锌对仔猪盲肠微生物组成和肠道功能的影响。同时,研究其作用效果和高剂量氧化锌间的区别与联系,以评估壳聚糖螯合锌对高剂量氧化锌的替代作用。

正常的肠道黏膜形态结构是保障仔猪肠道健康和发挥肠道功能的重要基础。盲肠形态结果显示,对照组仔猪由于大肠杆菌K88攻毒导致盲肠形态明显损伤,而壳聚糖螯合锌处理明显改善了仔猪盲肠黏膜形态,表明日粮中添加壳聚糖螯合锌在一定程度上缓解了大肠杆菌K88攻毒造成的断奶仔猪肠黏膜损伤。此外,和对照组相比,壳聚糖螯合锌处理显著降低了仔猪盲肠的隐窝深度,且与高剂量氧化锌处理效果相似。通常情况下,肠道隐窝深度和肠黏膜中细胞的生成率密切相关。隐窝深度增加表明隐窝基部细胞不断分化成肠上皮细胞,加快组织周转,提高营养素以及能量的消耗,影响仔猪肠道正常生理功能[21-22]。而隐窝深度降低则表明隐窝基部细胞转化成肠上皮细胞的速率变慢,细胞成熟度提高,分泌能力增强[23]。因此,壳聚糖螯合锌处理改善了大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪的盲肠形态结构,有利于维持仔猪盲肠的正常肠道功能。

仔猪肠道形态损伤会使肠道通透性提高,导致外界病原体更容易入侵,造成肠道功能和肠道微生物群落的紊乱。因此,我们进一步对盲肠菌群组成进行分析。盲肠菌群α多样性指数结果显示,4组仔猪盲肠菌群的α多样性指数无显著差异。因此,本试验结果表明,壳聚糖螯合锌对盲肠微生物群落种类未造成显著影响,但可能改变了某些微生物的丰度。β多样性结果显示各组之间微生物组成总体上存在差异。表明壳聚糖螯合锌对盲肠微生物组成有调节作用。门水平上的微生物组成分析结果显示厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为盲肠中的优势菌门。与对照组相比,壳聚糖螯合锌组和壳聚糖组中变形菌门的相对丰度显著降低。变形菌门包括多种潜在致病菌,如大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等。变形菌门丰度的增多会破坏肠道菌群的稳态,引起肠道功能的失调,导致宿主代谢紊乱和肠道炎症反应[24],因此,饲粮中添加壳聚糖螯合锌可以降低变形菌门的相对丰度从而有助于维持盲肠菌群的稳态。

属水平上微生物组成的分析结果显示,与对照组相比,日粮中添加壳聚糖螯合锌可以显著提高乳杆菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度,并降低链球菌属和布劳特氏菌属的相对丰度。氧化锌组布劳特氏菌属的相对丰度也显著降低,但乳杆菌属、普雷沃氏菌属和链球菌属的相对丰度在氧化锌组以及壳聚糖组中没有显著变化。高剂量锌对仔猪盲肠中乳杆菌属没有显著影响[25],我们的结果与之相一致。壳聚糖对盲肠中乳杆菌属丰度的影响较低[26],这也许与盲肠中菌群结构更复杂,影响因素更多有关。乳杆菌属是盲肠食糜中的主要菌属,它可以通过争夺营养物质来抑制条件致病菌生长,维持肠道微生物的平衡,通过促进紧密连接蛋白的表达,增强肠道屏障功能,并且能够促进肠黏膜免疫系统的成熟,激发局部免疫调节活性[27]。因此,壳聚糖螯合锌组中乳杆菌属丰度的增加有助于改善肠道健康状况。普雷沃氏菌是猪肠道中一种主要的膳食纤维发酵菌,以往的相关性分析结果显示,普雷沃氏菌9的丰度与肠道中短链脂肪酸的浓度呈显著正相关[28],并且与断奶后腹泻的仔猪相比,健康仔猪粪便微生物群中普雷沃氏菌科的丰度更高[29]。本研究中,壳聚糖螯合锌显著上调了普雷沃氏菌属的相对丰度,并且普雷沃氏菌属的相对丰度在壳聚糖组也有上升趋势。因此,推测壳聚糖为菌群发酵提供所需的碳水化合物,刺激普雷沃氏菌属丰度上升,促进碳水化合物的分解,提高肠道免疫功能,减少腹泻的发生。此外,链球菌是一种致断奶仔猪发病的机会致病菌[30]。因此,本试验中壳聚糖螯合锌组的链球菌的减少可能表明壳聚糖螯合锌有助于降低肠道疾病发生率,维持肠道健康。布劳特氏菌属在近期的研究中被发现具有促进短链脂肪酸产生等维持肠道稳态活性的作用,具有潜在益生菌特性[31]。布劳特氏菌属在肠应激综合征和高血脂患者的粪便中丰度增加[32-33]。此外,在一项研究中发现,仔猪粪便中布劳特氏菌属与血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和 TNF-α 呈正相关[34]。同种菌属中的不同物种功能还可能存在一定差异,因此,在本研究中,壳聚糖螯合锌处理造成布劳特氏菌属的降低对仔猪的健康是否有益还需要我们后续进一步的研究。综上所述,壳聚糖螯合锌调节了大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪的盲肠菌群结构,使潜在有益菌的相对丰度上升,潜在致病菌相对丰度下降,从而有利于维持肠道良好的微生态环境。

我们进一步分析了盲肠中微生物代谢产物的变化,结果显示,与对照组相比,壳聚糖螯合锌组仔猪盲肠内乙酸、丁酸、总SCFA和乳酸的浓度显著增加。同时,壳聚糖组盲肠食糜中丁酸、总短链脂肪酸和乳酸的浓度显著提高,高剂量的氧化锌处理提高了盲肠食糜中丁酸和总短链脂肪酸的浓度。这些结果表明与壳聚糖和高剂量的氧化锌处理相比,壳聚糖螯合锌组的盲肠微生物具有更强的发酵能力。以往研究表明,普雷沃氏菌9是短链脂肪酸产生菌,它的丰度与肠道中乙酸、丙酸和丁酸的浓度呈显著正相关[13],因此,壳聚糖螯合锌组中普雷沃氏菌9丰度的提高或许是其短链脂肪酸浓度增加的原因之一。乙酸被证明是一种维持肠道内环境稳态并具有抗炎功能的代谢产物,而丁酸有利于调节肠道通透性[35]。短链脂肪酸特别是丁酸可以抑制脂多糖诱导的核转录因子κB(NF-κB)炎症信号通路,从而缓解肠道的炎症反应[36]。此外,壳聚糖螯合锌和壳聚糖组盲肠食糜中的乳酸浓度显著增加,壳聚糖螯合锌和壳聚糖组乳杆菌属丰度增加是导致乳酸浓度提高的原因。随着乳酸浓度的变化,盲肠内容物pH值也随之下降。在盲肠中,较低的pH值更适宜乳酸杆菌等有益菌的生长,且可以抑制潜在致病菌的生长和定殖[37]。因此,壳聚糖螯合锌可以提高大肠杆菌攻毒仔猪盲肠食糜中SCFA和乳酸的浓度,降低盲肠pH值,有助于维持盲肠内环境稳态。

肠道微生物群落失衡,机会致病菌丰度增加,其释放的肠毒素使得肠上皮通透性提高,破坏肠道屏障功能,打破促炎因子与抗炎因子的平衡,促炎因子释放增多,导致肠黏膜的局部炎症反应[38]。本研究结果显示,与对照组相比,壳聚糖螯合锌组盲肠黏膜中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和INF-γ水平显著降低,这与前人报道的壳聚糖锌具有抑制促炎细胞因子释放的结果一致[39]。在动物发生应激或组织器官处于炎症状态时,中性粒细胞聚集到炎症部位并释放MPO,增强机体免疫反应[40]。在本试验中,壳聚糖螯合锌处理下调了盲肠黏膜中的MPO水平,表明肠道炎症反应受到了抑制,这可能是由于壳聚糖螯合锌改善了断奶仔猪盲肠的微生物组成,乳酸菌等有益菌的比例增加,调节炎症反应的丁酸等短链脂肪酸浓度提高,对肠道起到一定的保护作用,从而缓解了肠道黏膜的炎症反应。因此,饲粮中添加壳聚糖螯合锌可以减轻大肠杆菌K88攻毒仔猪盲肠黏膜的炎症反应,保护肠道健康。

综上所述,壳聚糖螯合锌可以改善大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪的盲肠形态结构,调节盲肠微生物群落组成,通过提高潜在有益菌的相对丰度,抑制潜在致病菌的生长,改善了肠道微生态环境。同时,壳聚糖螯合锌提高了盲肠中短链脂肪酸及乳酸的浓度,有助于调节肠道免疫功能,抑制肠道炎症反应,对于维持肠道健康具有积极的作用。