肺癌合并肺栓塞患者DNA甲基化基因的表达差异的分析研究①

唐 乐，李 宏，牛海文，曹国磊，马荣辉，何丽丽，罗 琴

（新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科，乌鲁木齐 830011）

表观遗传学调控是指非DNA结构改变导致的基因表达水平及相应功能的可逆性变化，其调控作用相对于遗传学突变更加频繁及普遍[1]。DNA甲基化是其主要的调控方式，参与机体正常生长发育，作用类似基因活性的调节器。近年研究发现DNA甲基化分布异常参与了癌症、血栓形成、慢性肺动脉高压等疾病的发生发展，基因转录上游调控序列的异常甲基化可导致抑癌基因沉默、癌基因高表达，促进癌症发生及转移[2-4]。静脉血栓栓塞症（venous thromboem bolism,VTE)是由基因、环境等多种因素参与作用的复杂疾病[5]，这些因素协同造就了个体的“血栓形成潜力”[6]。研究表明较高水平的整体DNA甲基化与早期原发VTE相关，且瘤患者形成VTE的风险增加4～7倍，20%恶性肿瘤患者会在其疾病病程中并发VTE，此类VTE称之为恶性肿瘤相关血栓（cancer associated thrombosis,CAT)，在实体瘤中CAT以肺癌合并最为常见[7]。CAT主要是由癌症相关因素驱动的，如肿瘤类型、分级、分期、抗肿瘤治疗等[8]，血液学机制涉及肿瘤细胞产生促凝因子、肿瘤局部压迫淤滞、全身性炎症状态等[9]，而凝血途径的激活亦是肿瘤扩散和侵袭性疾病发展的机制之一[10]。CAT导致患者住院率、发病率、延迟癌症治疗率的增加，是肿瘤患者的第二大死亡原因[11]。目前只有少数CAT的基因表达谱变化研究[12-13]，甲基化调控是否参与CAT形成过程中的分子机制需进一步研究。本研究对肺血栓形成和未形成的肺腺癌患者外周血样本进行RNAseq测序及甲基化芯片检测，联合分析肺腺癌合并肺栓塞患者的甲基化表观调控基因表达谱，拟寻找肺腺癌患者中可预测VTE发生的甲基化生物标志物，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2019年1月-2019年12月新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸内科收治的肺腺癌合并肺栓塞患者4例，其中男3例，女1例，年龄31～62岁，平均年龄（48.5±12.9）岁，收集同时期肺腺癌患者4例，其中男2例，女2例，年龄在40～75岁，平均年龄（59.0±15.6）岁，两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批（批准号：2019BC007），受试者均知情同意且签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准肺腺癌诊断标准[14]：经病理学证实为肺腺癌患者。肺栓塞诊断标准：参照欧洲心脏病学会急性肺栓塞塞诊疗指南（2019版）。肺癌相关肺栓塞诊断标准：在肺腺癌诊断前3个月或诊断后24个月内发生的肺栓塞。排除标准[15]：既往合并心脑血管疾病、慢性阻塞性肺病、哮喘、血液系统、肝肾功能异常等疾病史的患者。

1.3 方法室温下用EDTA抗凝管收集每位患者外周全血2.5 mL，储存于-80℃冰箱，采用TRIzol™Reagent（Invitrogen）提取总RNA，采用天根基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。

1.4 指标的测定

1.4.1 RNA-seq测序及数据处理采用样本总RNA构建转录组测序文库并质检，使用Illumina测序仪测序,对测序原始图像文件进行碱基识别并转化为原始测序序列（Sequenced Reads），经归一化处理后计算基因百万外显子的碱基片段(FPKM)值。采用Limma软件包进行有生物学重复或配对的差异比较，利用DESeq包进行没有生物学重复的差异比较。差异表达基因(differently expressed gene,DEG)筛选标准为：|log2FC|≥1且P≤0.05，(FC即差异表达倍数)[16]。

1.4.2 甲基化芯片杂交及数据处理样本基因组DNA行亚硫酸盐转化、NaOH变性、恒温过夜扩增；用随机内切酶使DNA片断化；沉淀及重悬DNA；与Illu-mina850K芯片杂交，DNA片段与两种特异性探针互补序列（（A/T和C/G））结合；清洗芯片；扫描芯片读取基因组甲基化水平结果。将芯片原始扫描数据idat文件直接导入R包ChAMP进行分析、过滤和归一化校正后得到高质量的CpG位点甲基化水平（Beta值）。利用R包Limma进行差异甲基化位点分析。显著差异CpG位点筛选标准为P＜0.05。

1.4.3 基因表达谱数据-甲基化数据联合分析计算基因转录上游区域（mRNA的TSS1500、TSS200、5’UTR和1stExon)的DNA甲基化△Beta值和基因表达log2FC的pearson相关性，显著甲基化驱动基因筛选标准为：0.7＜|r|≤1且P＜0.05；利用KOBAS注释系统将筛选出来的差异甲基化-差异表达基因进行GO功能和KEGG通路分析。

2 结果

2.1 肺腺癌合并肺栓塞组对比肺癌组的转录上游差异甲基化的表达差异根据转录组测序表达数据及DNA转录上游异常甲基化分布数据，研究者共筛选到CD177、RNASE1、GMPR、NTN4、HIST1H2BM、SMIM5、MARCH2、CMBL、LGALS3、NME4、KIR2DL1、RNASE1 ANKRD9、SPTB共14个相关甲基化驱动基因。在肺癌合并肺栓组中，对应基因的平均FPKM值为4.603、0.608,5.988、0.163、2.460、2.168、5.359、1.381、5.427、1.796、0.633、0.608、1.779、3.772；而相对于肺癌组，肺癌合并肺栓组的差异表达log2FC值分别为2.594、3.666、1.946、-2.748、1.859、1.512、1.352、2.327、2.027、1.076、2.438、3.666、2.106、2.198,见表1。

表1 肺腺癌合并肺栓塞组对比肺癌组的转录上游差异甲基化-差异表达基因（按r值排序）

2.2 肺腺癌形成肺栓塞过程中甲基化驱动基因GO功能14个甲基化驱动基因在生物过程中（蓝色）涉及了唾液腺形态形成中的支线、自然杀伤细胞抑制的信号通路、免疫突触的形成等；在细胞成分中（黄色），主要作为鸟苷酸还原酶复合体、血影蛋白相关的细胞构架成分；在分子功能中（红色），主要有层粘连蛋白结合功能、细胞外基质结合功能、鸟苷酸还原酶活性等功能，见图1。

图1 甲基化-差异表达基因富集GO功能条目图（前30位）

2.3 肺腺癌形成肺栓塞过程中甲基化驱动基因调控通路KEGG通路分析表明基因NME4和GMPR主要参与了嘌呤代谢通路的调控；KIR2DL1主要参与了移植物抗宿主病、抗原处理和提呈、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用通路的调控；NME4参与了嘧啶代谢通路的调控；HIST1H2BM参与了系统性红斑狼疮通路的调控；NTN4参与了轴突引导通路的调控；HIST1H2BM参与了酒精中毒、病毒致癌作用通路的调控；CMBL、NME4参与了代谢通路的调控，见图2。

图2 差异甲基化-差异表达基因富集KEGG通路条目（前10位）

3 讨论

本研究在肺腺癌合并肺栓塞组患者对比肺腺癌组患者的外周血标本中，筛选到14个甲基化调控差异基因，1个高甲基化负性调控低表达基因NTN4，13个低甲基化高差异表达基因，其中表达差异最明显的基因为RNASE1。对比肺腺癌组，在肺癌合并肺栓组中NTN4基因高甲基化，负性调控了NTN4的表达降低。NTN4即神经突起导向因子Netrin-4，该基因编码netrin蛋白家族的一个成员。既往研究中，NTN4在乳腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、胃癌等多种癌症高表达，并与癌细胞生长、转移及肿瘤血管生成相关[17-18]。另外，NTN4参与内皮细胞增殖、血管生成、抗炎等作用[19-20]。内皮功能障碍是血管病变背景下的一个主要问题，例如动脉粥样硬化或血栓形成。目前虽无NTN4和血栓或者CAT明确相关文献，根据本研究结果提示NTN4或参与肺癌患者肺栓塞的形成。对比肺腺癌组，在肺癌合并肺栓组中RNASE1（内皮细胞外核酸内切酶核糖核酸酶1）基因的转录上游调控序列差异性低甲基化分布，显著负性调控了RNASE1的表达增高。研究发现RNASE1在前列腺癌、乳腺肿瘤、胃癌等恶性肿瘤中呈高表达[21-23]。内皮细胞被认为是预防血栓事件和加速血栓消退的潜在靶点[24]。近年来，RNase1在内皮细胞选择性大量表达，被认为是保护内皮细胞免受损伤的相关分子，参与调节血管稳态[25]。这与本研究结果一致，而RNASE1的大量表达在肺癌合并肺栓形成中承担保护因素还是促进因素，其具体分子机制尚待研究。

另外，通过KOBAS注释系统进行GO功能和KEGG通路分析发现，这14个甲基化驱动基因涉及自然杀伤细胞抑制、免疫突触形成、层粘连蛋白结合、细胞外基质结合功能等分子功能，也可能与核苷酸代谢、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、移植物抗宿主病抗原处理和提呈、轴突引导等通路相关。基于以上，提示这些基因与炎症及免疫系统相关。研究表明炎症及免疫反应是血栓形成前状态，而肿瘤细胞具有血栓前特性和炎症反应特性，在CAT形成中起重要作用[26]。因此这些基因及通路或许是CAT的关键机制之一。本研究通过分析样本基因组的高通量数据，初步探讨了参与肺癌患者血栓形成过程中的甲基化驱动基因和信号通路，后期将针对这些甲基化驱动基因进行更深入的研究。