响应面法优化野菊花总黄酮的闪式提取工艺*

刘 滢，赵汝茹，王越振，田 波，徐秀泉

(江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)

野菊花为菊科植物野菊 (ChrysanthemumindicumL.)的干燥头状花序，有清热解毒、抗菌消炎等功效，是具有较高药食两用价值的常见中草药[1]。现代药理学研究表明野菊花具有抗细胞凋亡、抗炎、清除氧自由基、抗菌等多种生物活性[2-3]。植物化学研究表明，黄酮类化合物是其发挥抗炎、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用的物质基础[4-5]。野菊花广泛分布在我国大部分地区，野生资源丰富, 但对其黄酮类化合物的开发利用并不充分，而提取工艺的优选是提高该类活性成分开发利用潜力的首要环节。微波辅助、超声辅助提取等先进提取技术已经应用于野菊花总黄酮的提取工艺优化[6-7]，更为方便，快捷的提取技术还需要继续深入的开发和探究。闪式提取是近年来迅速发展起来的一种绿色、高效的提取技术，该技术基于高速剪切作用和分子渗滤原理，能够在数十秒甚至数秒内完成溶质传递的过程，具有提取时间短、效率高、能耗低等显著特点，已成功应用于多种类型植物活性成分的提取[8-9]。本文利用闪式提取技术来提取野菊花中的总黄酮类成分，结合响应面分析法中的中心组合设计原理Central composite design (CCD)对提取过程中的乙醇体积分数、提取时间、料液比等显著影响提取得率的因素进行优化，以期建立简便、易行、高效的野菊花总黄酮提取工艺，为进一步开发利用野菊花这一中草药提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材 料

野菊花购自江苏镇江九泰医药有限公司，样品粉碎过40目筛后置冰箱中保存备用。芦丁对照品 (批号：10080-201609，纯度≥98%)，购自中国食品药品检定研究院；其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪 器

UV-2600紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；ZHBE-50T闪式提取器，河南智晶生物科技发展有限公司；DHG-9145鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；BS 110 S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，金坛科兴仪器有限公司；Allegra X-30低温冷冻离心机，贝克曼库尔特 (美国) 有限公司；DK-8D恒温水浴锅,南京科尔仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 标准曲线的绘制

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH络合比色法建立总黄酮的含量测定方法[10]，具体操作步骤如下：精密称取芦丁对照品 10 mg置于50 mL量瓶中，用体积分数70%的乙醇溶解并稀释至刻度，获得200 μg·mL-1芦丁对照品储备液。分别量取上述储备液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL量瓶中，依次加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，0.3 mL 10%AlNO3溶液， 4 mL 4%NaOH溶液，每次加入间隔6 min，最后用体积分数70% 的乙醇定容至刻度，振荡摇匀，充分反应15 min后于 510 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标进行线性回归，求得线性方程为：A= 0.014C+0.004 (r=0.9997)。实验结果表明芦丁在10.0 ～ 80.0 μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 野菊花总黄酮的闪式提取及含量测定

精确称取粉碎过筛的野菊花粉末1.0g，加入一定体积的不同体积分数的乙醇溶液室温下浸泡 5 min，随后采用闪式提取器提取规定时间，提取结束后，在5000 r·min-1条件下离心 10 min，取上清液，将残渣重复上述过程提取若干次。合并收集上清液，用70%乙醇定容至250 mL。最后，取该溶液 1.0 mL，按照“2.1”项下所述方法测定其在510nm 处的吸光度值并计算总黄酮得率。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

3.1.1 乙醇体积分数的选择

精密称取粉碎过筛的野菊花粉末1.0 g 5份，分别加入体积分数为30、40、50、60、70% 的乙醇溶液30 mL提取120 s，计算不同体积分数乙醇条件下野菊花总黄酮提取得率，实验结果见图 1(a)，由实验结果可知，野菊花总黄酮提取得率在以体积分数60%乙醇作为提取溶剂时达到最大值为4.24±0.10%；随后再提高乙醇的体积分数，总黄酮得率有较为明显的下降趋势，说明野菊花中主要黄酮类化合物在体积分数60%的乙醇中溶解度较大，因此选择体积分数为60%乙醇溶液作为较佳的提取溶剂。

3.1.2 料液比的选择

精密称取粉碎过筛的野菊花粉末1.0 g 5份，分别加入体积分数为60%的乙醇溶液15、20、25、30、35 mL提取120 s，计算不同料液比下各提取液中总黄酮含量，实验结果见图1(b)。由结果可知，当料液比小于30 mL·g-1，随料液比的提高，总黄酮提取得率逐渐升高说明较高的溶剂体积能够将野菊花中的总黄酮充分的提取出来；当料液比超过30 mL·g-1，总黄酮的提取得率反而有所下降，这主要是提取体积的增加导致了闪式提取过程中机械剪切作用降低的缘故[11]。综上所述，在料液比30 mL·g-1时获得了最高的总黄酮得率，因此选择 30 mL·g-1作为最佳的料液比。

3.1.3 提取时间的选择

精密称取粉碎过筛的野菊花粉末1.0 g 5份，加入体积分数为60%的乙醇溶液30 mL分别提取30、60、90、120、150 s，比较提取时间下对野菊花总黄酮提取得率的影响，实验结果见图 1(c)。由图1(c)可知，在提取时间120 s时总黄酮得率达到了最大值；然后再延长提取时间总黄酮得率有下降的趋势，这可能是因为提取时间过长，加速了非黄酮类化合物溶解、释放的缘故。因此选择提取时间为120 s作为最佳提取时间。

3.1.4 提取次数选择

图1 不同因素对野菊花总黄酮提取得率影响Fig.1 Effect of different conditions on the extraction yield of total flavonoids from Chrysanthemum indicum

在体积分数为60%的乙醇溶液，料液比为30 mL·g-1，提取时间为120 s条件下连续提取4次，分析提取次数对总黄酮得率的影响，实验结果见图 1(d)。由实验结果可知，提取次数对野菊花总黄酮提取得率几乎没有影响，通过一次提取就几乎将野菊花中所有黄酮类化合物完全提取出来，因此在提取过程中固定提取次数为1次即可。

3.2 响应面实验设计

3.2.1 响应面实验安排及结果

根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、料液比和提取时间三个因素为自变量，野菊花总黄酮的提取得率为响应值，设计3因素3水平共17个实验点的响应面分析实验，其中12个为析因实验，5个为中心实验。实验方案与结果见表1。

表1 野菊花总黄酮闪式提取工艺响应面实验结果Table 1 Central composite design (CCD) experimental design of factors with experimental and predicted valuesover flash extraction of total flavonoids from Chrysanthemum indicum

3.2.2 建立模型方程与显著性检验

应用Design-Expert 8.0.5软件对表1中的数据进行二次多元回归拟合，得到乙醇体积分数(X1)，料液比(X2)，提取时间(X3)与野菊花总黄酮提取得率之间的二次多项回归方程：

Y=4.44+0.14 X1+0.21 X2+0.36 X3-0.042 X1X2-0.065 X1X3+ 0.077X2X3-0.17 X12-0.16 X22-0.23 X32

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表2。

表2 闪式提取野菊花总黄酮得率方差分析结果Table 2 ANOVA of flash extraction of total flavonoids from Chrysanthemum indicum

由表2回归方差显著性检验结果，获得影响闪式提取野菊花总黄酮得率高低的因素依次为提取时间(X3) >料液比(X2) >乙醇体积分数 (X1)；二次项中三因素对总黄酮提取率的曲面效应影响高度显著(P<0.01)；比较各因子间交互作用均不显著(P>0.05)。在本实验设计范围内，回归方程显著性检测p=0.0006 <0.001，极显著，模型的确定系数为0.9568，说明该模型能解释95.68%响应值的变化，即该模型预测结果让与实际实验结果拟合良好，试验误差小，应用响应曲面法优化方法优化野菊花总黄酮的闪式提取工艺是可行的。

3.2.3 响应面分析

根据回归方程，采用Origin8.5软件绘制出各因素交互作用的响应面等高线图和响应面图，结果见图2。等高线形状可以反映因素对响应值的影响程度以及因素之间交互作用的强弱，椭圆形表示两提取因素间的交互作用显著，圆形则表示二者之间交互作用不显著[12]。由实验结果可知，各因素间的交互作用等高线形状均接近于圆形，说明因素之间的交互影响并不显著，这与方差分析结果相符。通过响应曲面图的斜率不同因素对野菊花总黄酮提取得率的影响。由响应图可以看出，野菊花总黄酮得率均随着各个因素的变化先增加后降低，说明该因素设定的范围合理，能够在该范围内寻求到最大值。在三个因素中，提取时间的曲线最为陡峭，乙醇体积分数曲线最为平滑，说明提取时间对总黄酮得率的影响最为显著，乙醇体积分数提取得率的影响最弱，这同方差分析所得的结论也保持一致。

图2 因素间相互关系对野菊花总黄酮提取得率影响Fig.2 Response surface plot for interactions between three independent variables (extraction parameters) on extraction yields of total flavonoids from Chrysanthemum indicum: ethanol concentration and liquid to material ratio

3.2.4 最佳工艺条件的确定

表3 不同提取方法下野菊花总黄酮提取得率比较Table 3 Comparison of extraction yields of total flavonoids over Chrysanthemumindicum obtained from different extraction methods

为确定各因素的最佳取值，利用Design-Expert软件分析后，根据回归模型存在的最大值点计算并结合实际操作条件，获得闪式提取野菊花总黄酮最佳工艺条件为：采用体积分数61%乙醇，在料液比为34 mL·g-1条件下，闪式提取147 s，此时野菊花总黄酮提取得率的最大估计值为Y=4.698%。在该条件下进行操作，并同传统的加热回流提取进行比较，比较结果见表3。

由实验结果可知，在最佳闪式提取条件下，野菊花总黄酮得率为4.72%±0.06%，与预测值4.698%非常接近，说明优化的工艺非常稳定，采用闪式提取技术提取野菊花总黄酮切实可行；同传统的加热回流比较，闪式提取技术提取野菊花总黄酮效率高、时间短、能耗低，值得推荐使用。

4 结 论

将单因素实验和响应面分析法用于野菊花总黄酮的闪式提取工艺优化，获得最佳提取工艺条件：采用体积分数61%的乙醇，在料液比为34 mL·g-1条件下，闪式提取147 s，此时野菊花总黄酮得率为4.72%±0.06%，实验结果与所建立的数学模型预测值相符。同传统的回流提取相比较，闪式提取方法绿色、环保，提取效率高、能源消耗小，将该实验方法应用于野菊花总黄酮的提取为该药材的进一步的开发奠定了基础。