采用立方体取样法提高小麦根系研究精准性的探讨

杨一晨，杨习文，吴 寅，黄 源，徐利利，付锦州，郭芳芳，周苏玫，贺德先

（1. 河南农业大学农学院/国家小麦工程技术研究中心/省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室/河南粮食作物协同创新中心，河南 郑州 450046；2. 河南省农业科学院，河南 郑州 450002）

作物根系形态研究的难点在于如何对大田作物的根系进行有代表性的取样[1]，且根系研究的准确性与根系样品的代表性密切相关[2]。根系取样方法显著影响根系研究质量，使用不同的取样方法获取的根系样品，对大田真实情况的反映程度不尽一致。使用不同的取样方法造成根系形态和生理生化指标的测定值差异较大，从而难以准确描述根系实际的生长发育和生理状况，使同类研究结果或同一指标之间差异较大，缺乏可比性[3]。因此，规范根系取样方法具有重要的理论与实践意义。近几十年来，随着科技发展，作物根系研究手段取得较大进展[4‐6]。目前，国内外采用的作物大田根系研究方法种类繁多[7‐10]，根据研究目的可分为离体取样法和原位观测法。作物根系原位观测法，如微根管法、多层螺旋CT 成像法、核磁共振成像法等[11‐17]，虽然具有无损伤、非破坏性观测根系的优点，但其无法直接获取根系样品进行离体测定，亦不能通过根系实体研究其性质；相较于根系原位观测法，离体根系取样法更有助于开展小麦根系形态与生理方面的研究，直接获取的根系样本可用于测定根的长度、体积、形状、颜色、分布状态，也可测定生理生化指标和空间分布指标。目前，在作物大田试验研究中，根系的获取仍以从土壤中分离的方法为主，其中应用较广泛的有挖掘法[9]、土钻法[1,18]、剖面法[19]等。土钻法在研究不同土层根系特性时具有优越性，但样品量小，代表性仍存在争议；挖掘法由于采用工具、方法以及取样位点不一，误差较大；而剖面法取样面单一、代表性差，而且操作过于费时费力，收集样品时间过长。目前，在小麦根系研究中，对不同取样方法根系测定值之间的比较鲜有报道。为准确了解小麦根系在实际土壤中的生长发育和生理状况，根据小麦种植状况，选用取样土体完整且规格一致的立方体根系取样法以及目前根系研究中常用的钻取法和挖掘法，就小麦全生育期不同土层中根系形态和根系活性的测定值进行比较研究，着重探讨不同取样法的取样精度、代表性问题，以期使小麦田间根系取样方法规范化、标准化，提高根系研究结果的可靠性和准确性，同时也为作物根系研究方法的改进和发展提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验地概况及试验材料

试验于2018—2020 年在河南省郑州市中牟县河南省农业高新科技园进行。试验田土壤为潮土，0～20、20～40 cm 土层土壤有机质含量分别为11.5～16.7、8.7～10.3 g/kg，全氮含量分别为0.81～0.89、0.75～0.78 g/kg，碱解氮含量分别为48.8～50.6、40.6～45.2 mg/kg，有效磷含量分别为21.2～23.4、19.8～20.5 mg/kg，速效钾含量分别为101.9～111.3、128.6～135.8 mg/kg（表1）。

表1 试验地养分含量状况Tab.1 Content of nutrients in the experimental field

供试小麦材料为黄淮平原麦区种植面积较大且具有代表性的品种：弱春性品种西农979（国审麦2005005）和半冬性品种周麦27（国审麦2011003）。

1.2 试验设计

采用裂区设计，主区为2 个小麦品种，副区是3种根系取样方法，分别是立方体取样法（Cube sampling method，CSM）、根钻法（Auger sampling method，CK1）和挖掘法（Digging method with a spade，CK2）。取样土层分为2 层：0～20 cm 和20～40 cm。小区面积为18 m2（3 m×6 m），15 行区，行距20 cm。重复4 次。分别于2018 年10 月13 日和2019 年10 月15 日适墒播种，基本苗为240 万株/hm2，2019 年5 月30 日和2020 年5 月29 日收获。采用喷灌设施进行灌溉，其他栽培管理同一般高产田。

1.3 根系取样方法

CSM：根据小麦的行距，采用边长20 cm 立方体取样盒取样，材质为合金，下部带刃不封口。田间取样时使用重力锤在代表性的取样位点（图1）将取样盒均匀置入小麦行中，完整取出不同耕层的土壤-根系样品。

CK1：使用内径为5 cm 的根钻，每组（重复）在行切①、行上②、行间③处取样（图1），三钻合一[18]，为1个土壤-根系样品。

CK2：选择代表性样点，在小麦播种行上，规划出20 cm×20 cm×20 cm 的土体体积（图1），用铁锹挖掘出土壤-根系样品。

图1 不同取样方法的根系取样位点Fig.1 Root sampling sites for different root sampling method

1.4 测定项目及方法

分别于2018—2019 年小麦越冬前（Prior to wintering，PW）、返青期（Re‐growing stage，RS）、拔节期（Jointing stage，JS）、开花期（Anthesis stage，AS）、灌浆期（Grain‐filling stage，GS）、蜡熟期（Late dough stage，LS）取0～40 cm 土层土壤-根系样品，用于根干质量和根系活性分析。分别于2019—2020 年小麦越冬前、开花期、灌浆期、蜡熟期取0～40 cm 土层土壤-根系样品，用于根系形态、干质量及活性分析。将不同处理的土壤-根系样品，用清水缓慢浸泡后冲洗干净（去杂质），获得待测根系样品。

1.4.1 根系形态 用根系扫描仪（Epson Expression 12000XL）扫描根样，获得图像；用WinRHIZO 根系分析系统（Regent Instruments Inc.，Canada）进行图像分析，获得根长、根体积、根表面积，计算单位体积内的根长、根体积和根表面积。

1.4.2 根干质量和根干质量损失率 将根系样品置于105 ℃下杀青30 min，80 ℃烘至恒质量，称质量，并计算单位体积内的根干质量。

根干质量损失率=（CSM 根干质量-CK1 或CK2根干质量）/CSM根干质量×100%。

1.4.3 根系活性 选取0.5 g 鲜根混样，采用改良TTC法[20]测定根系活性。

1.5 数据处理

采用Excel 2016 和SPSS 19.0 进行数据处理和统计分析，用Origin 2018 作图，采用SPSS 19.0 进行方差分析（Duncan’s 新复极差法）和Pearson 相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同取样方法下小麦根系形态差异

2.1.1 根长 由图2 可知，2019—2020 年，随着生育进程的推进，小麦根长呈现逐渐增加后趋于稳定的趋势，于蜡熟期达到最大值。在各生育时期0～20 cm 土层的小麦根长明显长于20～40 cm 土层。CSM 处理小麦根长与CK1、CK2 处理在20～40 cm土层的差异大于0～20 cm 土层，在0～20、20～40 cm，CSM 处理小麦根长分别比CK1 处理平均增加了52.15%、144.00%，比CK2 处理平均增加了11.61%、42.29%。不同生育时期、不同土层2 个小麦品种根长表现为CSM>CK2>CK1。在越冬前、开花期、灌浆期、蜡熟期，CSM 处理根长比CK1 处理平均增加了0.115、0.199、0.180、0.243 cm/cm3，比CK2处理平均增加了0.013、0.086、0.090、0.088 cm/cm3，CSM 处理与CK1 处理的差值在蜡熟期最大，与CK2处理的差值在灌浆期最大。由此可知，采用立方体取样法获取的小麦根系样品根长更长，比较而言，立方体取样法与其他方法在20～40 cm 土层的差异大于0～20 cm 土层，且在小麦生育后期（灌浆期—蜡熟期）的差异相较其他生育时期更大。

图2 不同取样方法下小麦根长的变化Fig.2 Change of wheat root length under different sampling methods

2.1.2 根表面积 由图3 可知，2019—2020 年，随着生育进程的推进，小麦根表面积呈现逐渐增加的趋势，于蜡熟期达到最大值。不同生育时期、不同土层2 个小麦品种根表面积均表现为CSM>CK2>CK1。在0～20 cm 土层，CSM 处理根表面积分别比CK1、CK2 处理平均增加了47.72%、10.39%；在20～40 cm 土层，CSM 处理根表面积分别比CK1、CK2 平均增加了97.96%、44.77%，CSM 处理与CK1、CK2 处理在20～40 cm土层的差异大于0～20 cm土层。在越冬前、开花期、灌浆期、蜡熟期，CSM 处理根表面积比CK1 处理平均增加了0.009 3、0.020 8、0.020 3、0.023 5 cm2/cm3，比CK2 处理平均增加了0.002 3、0.007 6、0.010 1、0.008 1 cm2/cm3，CSM 处理与CK1处理的差值在蜡熟期最大，与CK2 处理的差值在灌浆期最大。由此可知，在小麦根表面积研究中，立方体取样法最优，挖掘法次之，根钻法最差，立方体取样法与其他方法在生育前期（越冬前）的差异较小，生育后期（灌浆—蜡熟期）差异较大，此外，在20～40 cm 土层的差异相较0～20 cm 土层更大。

图3 不同取样方法下小麦根表面积的变化Fig.3 Dynamic change of wheat root surface area under different sampling methods

2.1.3 根体积 由图4 可知，2019—2020 年，随着生育进程的推进，小麦根体积呈现逐渐增加后趋于稳定的趋势。总体上，不同生育时期、不同土层2个小麦品种根体积均表现为CSM>CK2>CK1。在0～20、20～40 cm 土层，CSM 处理根体积分别比CK1 处理平均增加了50.07%、90.70%，分别比CK2 处理平均增加了11.55%、29.50%，CSM 处理与CK1、CK2 处理在20～40 cm土层的差异大于0～20 cm土层。在越冬前、开花期、灌浆期、蜡熟期，CSM 处理根体积分别比CK1 处理平均增加了67.02、186.35、168.37、292.04 cm3/m3，比CK2处理平均增加了18.34、95.80、91.60、11.89 cm3/m3，CSM 处理与CK1 处理的差值在蜡熟期最大，与CK2 处理的差值在灌浆期和蜡熟期较大。由此可见，在大田根体积的研究中，使用立方体取样法相较于其他取样方法根体积损失更小，能获得更大的测量值，在20～40 cm 土层立方体取样法与另外2 种方法根体积的差异大于0～20 cm，另外，在生育后期（灌浆—蜡熟期）的差异较生育前期增大。

图4 不同取样方法下小麦根体积的变化Fig.4 Dynamic change of wheat root volume under different sampling methods

2.2 不同取样方法下小麦根干质量差异

由图5 和表2 可知，随着生育进程的推进，小麦根干质量逐渐升高后趋于稳定。相较于CSM 处理，CK1 处理根干质量损失率为27.5%～62.4%，CK2 处理根干质量损失率为8.2%～49.0%。不同年份、不同生育时期、不同土层2 个小麦品种根干质量总体表现为CSM>CK2>CK1。CK1 与CK2 处理在0～20 cm 土层的根干质量损失率低于20～40 cm 土层。2018—2019 年，CK1 处理平均根干质量损失率为49.3%（0～20 cm）、51.7%（20～40 cm），CK2 处理为19.9%（0～20 cm）、33.4%（20～40 cm）；2019—2020年，CK1 处理平均根干质量损失率为38.5%（0～20 cm）、53.3%（20～40 cm），CK2 处理为11.2%（0～20 cm）、23.0%（20～40 cm）。在2018—2020 年，0～20 cm 土层，CSM 处理根干质量在生育前期（越冬前、返青期）与CK2 处理的差异未达到显著水平，在生育后期（灌浆期后）与CK1 处理的差异达到显著水平；20～40 cm 土层，CSM 处理根干质量在灌浆期与CK1 处理的差异达到显著水平。由此可见，在小麦大田根干质量的研究中，采用立方体取样法获取的根样损失更小，更接近真实值，挖掘法与立方体取样法差异较小，根钻法最差。

表2 CK1和CK2处理较CSM处理的根干质量损失率Tab.2 Loss rate of dry weight of wheat root of CK1 and CK2 treatments compared with CSM treatment%

图5 不同取样方法下小麦根干质量的变化Fig.5 Dynamic change of dry weight of wheat root under different sampling methods

2.3 不同取样方法下小麦根系活性差异

由图6可知，随着生育进程的推进，小麦根系活性总体呈逐渐降低的趋势。不同土层间，0～20 cm土层根系活性高于20～40 cm 土层；不同年份、不同生育时期、不同土层2 个小麦品种根系活性均表现为CSM>CK2>CK1。不同生育时期，CSM 处理根系活性与CK1、CK2 处理相差较大，在越冬前为8.00～73.19 μg/（g·h），在蜡熟期为0.81～11.19 μg/（g·h），生育前期的差异大于生育后期。在不同土层中，不同取样方法根系活性差异表现为20～40 cm 土层大于0～20 cm 土层。2 a 2 个小麦品种各生育时期CSM处理根系活性分别比CK1 处理平均提高了71.49%（0～20 cm）、91.80%（20～40 cm），比CK2 处理平均提高了25.82%（0～20 cm）、36.89%（20～40 cm）。由此可见，大田试验中采用立方体取样法所获取的根样，新鲜度保持效果好，生理活性测定值高，更接近田间根系的实际生理状态，尤其是在深层取样时，立方体取样法的效果更好，此外在生育后期不同取样方法根系活性测定值差值较小，生育前期差值则较大。

图6 不同取样方法下小麦根系活性的动态变化Fig.6 Dynamic change of wheat root vigor under different sampling methods

2.4 不同取样方法下小麦根系性状的相关性

鉴于不同取样方法在根系性状测定值上的差异，为了进一步了解CSM 法测定值与其他方法测定值之间的关系，采用Pearson相关系数和回归方程进行相关性和回归分析。由表3 可知，不同取样方法的根系性状测定值之间均呈极显著的正相关关系，相关系数介于0.955～0.989。就根系活性、根干质量和根系形态的测定值而言，CSM与CK1、CK2均呈幂函数的回归关系，回归方程分别是y=1.523 8x1.0080（CSM ＆ CK1，0～20 cm）,y= 2.068 5x0.9947（CSM ＆CK1，20～40 cm），y=1.114 4x1.0017（CSM＆CK2，0～20 cm），y=1.379 9x0.9935（CSM ＆ CK2，20～40 cm）。CSM 与CK1、CK2 的回归方程P值均小于0.01（R2介于0.994 1～0.999 3）。由此可知，回归方程的建立可在不同土层分析CSM 与其他方法的关系，通过CK1、CK2 的根系性状测定值可估算CSM 的根系性状测定值。因此，在大田根特性研究中，可使用回归方程对根钻法和挖掘法的植株性状测定值进行矫正，从而得到更准确、代表性更好的研究结果。

表3 不同取样方法下小麦根系性状相关系数Tab.3 Correlation coefficient between root traits under different sampling methods

3 结论与讨论

3.1 根系取样方法对小麦根系研究的代表性和精准性的影响

作物根干质量和根系形态的分布体现了作物生物量的分配策略[1，21]，是衡量与反映其生长情况的重要性状。本研究结果表明，采用立方体取样法获取的根系样品根干质量和根系形态测定值较挖掘法和根钻法高，且根样损失更小，更接近真实值，挖掘法与立方体取样法差异较小，根钻法代表性最差，在0～20、20～40 cm 土层以及不同品种的不同生育时期均有体现。前人研究表明，挖掘法测定的土层根量占总根量的比例规律性较差，以土层根量估计小麦总根量的方法可能存在较大的系统误差；根钻法测定的结果无论从根系可检出程度还是从估计总根量的角度讲，均较挖掘法优[18]。本研究采用根钻法虽能获取一定体积的土壤根系样品，但体积远远小于其他2种方法，因其获取的根量小，在根系冲洗过程中损失的根量相对就多，在试验过程中的误差更大，导致其根干质量和根系形态指标值小于其他2种取样方法，此外，根钻法的取样点不能均匀代表小麦根系分布状况是造成测定值小的另一原因。

小麦根系生理活性可反映根系新陈代谢能力，其与植株性状、籽粒产量密切相关[22]。在科学研究中，常用根系活性来反映植物的新陈代谢能力和抗性的强弱[23]。本研究结果表明，不同的根系取样方法对根系活性测定值的影响不同，使用立方体取样法获取的根系样品根系活性测定值较挖掘法和根钻法更高。前人研究表明，不同部位根系活力差异明显[6]。本试验麦垄之间行距为20 cm，根钻法获取的土壤样品根量较少，钻头内径小（5 cm）导致根系样品断根多；挖掘法获取根系样品时需多次挖掘，对根系损伤大，且取样量不够严格一致；立方体取样法获取的土壤根系样品（取样盒边长为20 cm）相较于上述2 种方法更完整更具有代表性，这是造成立方体取样法的根系活性测定值更高的原因。

3.2 立方体取样法在小麦根系研究中的优越性

采用合适的取样方法对大田作物的根系进行有代表性的取样并对其进行估计是了解作物生产力的基础[7，24]。根钻法和挖掘法都是用于作物根特性研究的常用根系取样方法。前人研究表明，根钻法虽分析不同土层根系特性时具有优越性，但其对于根系密度较小的作物往往会由于钻头直径太小而导致误差过大，同时由于它获取的样本量少不适用于根形态学方面的研究[1，21]。根钻法在获取根系样品时，水平方向选择不同的取样点，会对根系的估算产生一定的影响[1]。本研究虽采用三钻合一的方法获取样品，但取样量和取样代表性仍低于立方体取样法，且选择取样点时人为误差较大，精确性易受操作影响。挖掘法省时省工、工具简单、成本低，但在挖掘过程中土壤易散，取样困难，往往需要多次挖掘才能够获取所需的根系样品，对根系损伤大，难以获取一定体积的完整土样，不如立方体取样法获得的样品量精确，导致研究结果的精准度较低。立方体取样法的优点如下：1）准确性，立方体取样法获取的土体样品体积精确度高，可减小试验误差；2）代表性，立方体取样法根据小麦行距设置边长为20 cm 的取样盒，保证了取样土体和取样量的代表性；3）完整性，相较根钻法和挖掘法，立方体取样法获取的土样保持了小麦根系的原状，对根系损伤更小，断根更少；4）一致性，相较于根钻法和挖掘法，立方体取样法的具体取样位置和取样土层严格规范且保持一致，人为误差小，不易受操作的影响。综合以上因素，立方体取样法既保证了样品量的一致性和准确性，同时也保证了根系样品的完整性和代表性，极大地减小了田间取样的试验误差，从而使得其在根系活性、根干质量以及根系形态的研究中体现出较大的优越性。

本研究根系样品采用根系扫描仪和WinRHIZO根系分析系统（Regent Instruments Inc.，Canada）进行测定，相较于传统方法，提高了研究结果的精准性，更具有说服力。通过立方体取样法与其他方法的对比分析，使得研究者更加了解和关注由于取样方法造成同一研究结果差别大的问题，同时意识到根系取样方法规范化与标准化的重要性。