基于抗菌及抗炎作用探究板蓝根微粉对雏鸡沙门菌病的防治效果

郝敬友，霍墨涵，梁 蒙，侯耀杰，王洪斌*，于文会,3*

(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.东北农业大学 中兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150030)

鸡白痢沙门菌病是由鸡白痢沙门菌引起的一种常见传染病，世界各地均有流行，对养鸡业危害较大，每年都会给家禽养殖业造成巨大的经济损失[1]。鸡白痢沙门菌属于肠杆菌科，具有专一宿主适应性[2]，自然宿主是鸡，易感染各品种鸡，2周龄以下的雏鸡更易感染并呈流行性[3]。鸡白痢沙门菌除了可以接触传播外，也可以通过种蛋进行垂直传播[4]。鸡感染鸡白痢沙门菌后，心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、卵巢、睾丸以及盲肠均有程度不同的病理变化。虽然发达国家鸡白痢沙门菌病几乎从商品雏鸡中消失，但许多发展中国家还有待解决。目前，我国部分家禽养殖业为避免发生鸡白痢沙门菌病，普遍采取定期给雏鸡投喂抗菌药物，或用生物制品进行防治[5]。抗生素是目前最常用的防治鸡白痢沙门菌病的方法，但长期使用易产生环境耐药菌株，导致抗生素的用量不断加大或更换抗生素进行防治。随着耐药性的升高以及耐药谱的变宽，在一定程度上增大该病防治的难度[6]，同时给动物源性食品安全存在潜在风险。中草药防治畜禽疾病是在中兽医理论指导下，有着悠久的历史，近年来在减抗限抗实施过程中，凸显中草药防病的独特优势。但由于受市场供需关系影响，近年来中草药价格也在快速上涨，影响中草药的推广应用。如何降低中草药的开发应用成本，适合动物养殖中的应用，是研发经济动物用中草药产品必须遵循的原则。中药微粉采用先进的粉碎设备，粉碎粒度极小(粒径可达300目以上)，细胞破壁率可达100%，极大提高了中药活性成分的溶出，提高临床疗效[7]。与传统中药粉碎技术相比，中药微粉碎破壁可免去复杂而漫长的穿透细胞壁过程和药物释放从而带来的延缓，有利于中药活性成分的快速溶出[8]。相对于中药提取物，在中药煎煮或提取过程中，不但有活性成分丢失，而且因加工成本也高。而且中药微粉属于物理性加工，在加工过程中，不引进化学成分，省去了提取物加工过程的浓缩、除杂、分离纯化等过程，降低了中草药加工成本。因此，中药微粉在畜牧业上的应用具有很好的开发价值。

板蓝根味微苦、性寒，归心、胃经。板蓝根分为北板蓝根和南板蓝根，属十字花科植物。南板蓝根为马蓝的根，北板蓝根属菘蓝的根。菘蓝的根被收录《中国兽药典》。板蓝根所含化学成分较为复杂，可分为生物碱类、有机酸类、黄酮类、木脂素类、核苷酸类、氨基酸类、甾体类、告依春类[9]。大量文献在多个层面对板蓝根抗炎方面做了大量的阐述，相关结果显示板蓝根具有很强的抗炎作用[10-11]。通过二甲苯所致小鼠耳肿胀和大鼠足趾肿胀试验，发现板蓝根对其有很明显的抑制炎症作用[12-13]。本试验以雏鸡白痢沙门菌病为研究对象，通过板蓝根微粉抗菌及抗炎作用，利用板蓝根微粉防治雏鸡白痢沙门菌感染模型试验，为板蓝根微粉防治雏鸡白痢沙门菌病临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细菌及主要试剂板蓝根微粉和普通粉均购于哈尔滨绿达生动物药业有限公司(普通粉粒径80目，微粉粒径300目)。鸡白痢沙门菌CVCC 533，购于中国微生物保藏中心；鸡白痢分离菌株来自东北农业大学微生物教研室馈赠。二甲苯、D-半乳糖、阿司匹林、干酵母，cAMP与PGE2试剂盒，IL-1与TNF-α试剂盒，均购于南京建成科技有限公司。

昆明小鼠70只，Wistar雄性大鼠80只，均购于黑龙江省哈尔滨医科药大学实验动物中心。饲养条件：室温22～25℃，相对湿度为(55±5)%，12 h明暗交替照明，自由进食、饮水。1 日龄健康雄性雏鸡 165只，购于黑龙江哈尔滨市某孵化场。

1.2 板蓝根微粉的最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)的测定采用二倍稀释法测定MIC。取不发生浑浊变化的试管内培养液接种于营养琼脂培养基平板，培养24 h后观察菌落数确定MBC。

1.3 板蓝根微粉对鸡白痢沙门菌菌体形态和结构的影响将培养至对数生长期的鸡白痢沙门菌用LB 液体培养基释成107CFU/mL 的菌液，取出 2 mL 菌液并加入 18 mL 质量浓度为 MIC的板蓝根微粉水溶液的试管中，置于摇床中培养(37℃，180 r/min) 10 h 后，以 6 000 r/min 离心10 min，收集菌体。将正常培养至对数生长期的沙门菌作为对照组，扫描电镜和透视电镜观察菌体形态。

1.4 板蓝根微粉抗耳肿胀作用将70只昆明小鼠随机分为7组，板蓝根微粉低剂量组、中剂量组、高剂量组，板蓝根普通粉低剂量组、中剂量组、高剂量组，炎性对照组。每组10只，给药组均按每天2.5，5.0，10.0 g/kg分别给药，炎性对照组灌胃生理盐水。1次/日，连续3 d。末次给药后30 min，取0.1 mL 二甲苯涂于各组鼠右耳内外两侧(即每侧50 μL)，左耳不作处理为正常耳对照。致炎1 h后，处死小鼠，用8 mm打孔器打下的耳片进行测质量，按以下公式进行计算：

肿胀度=致炎右耳质量-非致炎左耳质量；

肿胀率=(致炎右耳质量-非致炎左耳质量)/非致炎左耳质量×100%。

1.5 板蓝根微粉的解热作用及对下丘脑中cAMP和PGE2影响将Wistar雄性80只大鼠置于实验室适应7 d。之后每天进行适应性测肛温2次，间隔1 h，连续测3 d，使其适应测肛温的操作。第3天下午开始禁食，禁食10 h，第4天进行正式试验，每30 min 测肛温1次，连续测3次，选取体温在37.0℃ 左右，体温变化不超过0.4℃的大鼠供试验用。取其平均值为基础体温。然后正常对照组在背部皮下注射生理盐水10 mL/kg，其余每组大鼠从背部皮下注射10% 酵母混悬液10 mL/kg，注射后每2 h测1次体温，测3次，6 h后体温升高不足0.8℃的大鼠淘汰，将合格大鼠随机分为空白组、模型组、阿司匹林阳性对照组，板蓝根普通粉低、中、高组，板蓝根微粉低、中、高组，每组8只灌胃给药10 mL/kg，空白组和模型组灌服生理盐水，阿司匹林组给药0.100 g/kg，其他低中高组分别按2.500，5.000，10.000 g/kg剂量灌服板蓝根，给药后每小时测量肛温1次，连续测量3次，记录各个时间点体温变化情况[21]。

试验9 h后，立即处死大鼠，冰浴下取下丘脑，-80℃冰箱保存待测。按cAMP和PGE2试剂盒说明书进行加样测定。

1.6 板蓝根微粉对雏鸡白痢沙门菌的防治试验1日龄雄性雏鸡165只，随机选取15只雏鸡作为空白对照组，其余150只采用人工感染鸡白痢沙门菌制备雏鸡感染模型，感染组共10组，每组15只，分别为模型组，板蓝根微粉高、中、低剂量预防组，板蓝根普通粉高、中、低剂量预防组，板蓝根微粉治疗组，板蓝根普通粉治疗组，西药治疗组。1日龄时，板蓝根微粉高、中、低剂量预防组和板蓝根普通粉高、中、低剂量预防组分别按0.500，0.250，0.125 g/只，连续灌服3 d。5日龄时，空白组雏鸡灌服生理盐水 0.5 mL/只，其余各组雏鸡按1×109CFU/mL 剂量灌服鸡白痢沙门菌分离株的菌液 0.5 mL/只。6～12 h部分出现临床症状后，板蓝根微粉治疗组灌服板蓝根微粉水溶液，质量浓度 1 g/L，给药剂量为0.5 mL/只；板蓝根普通粉治疗组灌服板蓝根普通粉水溶液，质量浓度 1 g/L，给药剂量为0.5 mL/只；西药治疗组用质量浓度 25 g/L 的恩诺沙星水溶液，给药剂量为0.5 mL/只，均连续灌服 5 d。空白组、模型组与预防组连续给予5 d 等量的生理盐水。观察并记录各组死亡率情况。

发病率=(每组发病实验动物只数/每组实验动物总数)×100%；

保护率=(每组被保护实验动物只数/每组实验动物总数)×100%；

病死率=(每组死亡实验动物只数/每组实验动物总数)×100%。

1.7 血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性测定试验结束后，随机选取 5只，心脏采血，室温静置过夜，3 000 r/min 离心 10 min，分离血清，-20℃ 保存备用。采用全自动生化分析仪测定血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)含量。

1.8 肝脏中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素1(IL-1)含量测定试验结束后，随机选取 5只，收集肝脏，-80℃ 保存，按照试剂盒说明进行IL-1、TNF-α的含量测定。

2 结果

2.1 鸡白痢沙门菌的MIC和MBC测定结果测定结果显示，板蓝根微粉对鸡白痢沙门菌的MIC为0.125 kg/L，MBC为0.250 kg/L。板蓝根普通粉对鸡白痢沙门菌的MIC为0.250 kg/L，MBC为0.500 kg/L。

2.2 板蓝根微粉对鸡白痢沙门菌菌体形态和结构的影响扫描电镜下观察到沙门菌无芽胞，菌端钝圆，无荚膜，无鞭毛(图1A)。板蓝根微粉作用10 h后，菌体出现溢缩、弯曲、凹陷(图1B)。透射电镜下观察到正常沙门菌体结构完整，细胞壁膜光滑(图2A)。板蓝根微粉作用10 h后的沙门菌菌体有变形现象，细胞壁膜弯曲，细胞质与细胞壁出现分离(图2B)。

A.正常鸡白痢沙门菌;B.板蓝根微粉作用后

A.正常鸡白痢沙门菌;B.板蓝根微粉作用后

2.3 板蓝根微粉抗小鼠耳廓炎性肿胀作用由图3可知，模型组肿胀率超过了100%，说明抗炎模型造模成功。灌服药物1 h后，各给药组小鼠耳廓肿胀度和耳廓肿胀率均有所降低。在肿胀度和肿胀率上，普通粉高、中剂量，微粉高、中剂量组均显著低于模型对照组(P<0.05)，而低剂量的普通粉和微粉与模型组相比无明显差异(P>0.05)，尽管板蓝根微粉和板蓝根普通粉高剂量均有很强的抗炎效果，但微粉高剂量的抗炎效果强于普通粉高剂量(P<0.05)。

M．模型组；PL.普通粉低剂量组；PM.普通粉中剂量组；PH.普通粉高剂量组；CL.微粉低剂量组；CM.微粉中剂量组；CH.微粉高剂量组。a.与空白组比较(P<0.05)，b.与模型组比较(P<0.05)，d.与微粉组比较差异显著(P<0.05)；每组数据以表示。下同

2.4 板蓝根微粉的解热作用及对下丘脑中cAMP和PGE2影响检测结果由图4可知，与空白组相比，各给药组在0～6 h迅速升高，体温升高1.4℃以上，说明以干酵母作为外源性致热原的大鼠发热模型发热比较稳定，造模成功。阿司匹林组和板蓝根微粉高剂量组在给药1 h后，可显著抑制体温上升，达到解热效果；与模型组相比，板蓝根普通粉高剂量组在给药2 h后显体温降低；与模型组相比，普通粉中剂量和微粉中剂量组在给药2 h后体温降低。从图5可知，模型组、普通粉低剂量组和微粉低剂量组中的cAMP显著低于空白组(P<0.05)，阿司匹林组和微粉高剂量组中的cAMP显著高于模型组(P<0.05)；与空白组相比，模型组、普通粉低剂量和微粉低剂量组中的PGE2显著升高(P<0.05)，与模型组相比，阿司匹林组和微粉高剂量组明显抑制PGE2含量的增高(P<0.05)；普通粉高剂量组的cAMP和PGE2显著高于微粉高剂量组(P<0.05)；而微粉和普通粉的中剂量、低剂量组差异不显著(P>0.05)。

图4 不同时间点体温变化

K.空白组；M.模型组；A.阿司匹林组；PL.普通粉低剂量组；PM.普通粉中剂量组；PH.普通粉高剂量组；CL.微粉低剂量组；CM.微粉中剂量组；CH.微粉高剂量组

2.5 板蓝根微粉对雏鸡鸡白痢沙门菌病的防治效果由图6可知，阳性组死亡率73.3%，造模成功。板蓝根微粉预防高、中、低各剂量组死亡率均不超过26.7%，优于板蓝根普通粉预防组；板蓝根微粉治疗组和板蓝根普通粉治疗组死亡率差异不明显，且预防效果优于治疗效果。恩诺沙星可溶性粉治疗组治疗效果优于板蓝根微粉治疗组和板蓝根普通粉治疗组。

K.空白对照组；M.模型组；PYL.普通粉预防低剂量组；PYM.普通粉预防中剂量组；PYH.普通粉预防高剂量组；CYL.微粉预防低剂量组；CYM.微粉预防中剂量组；CYH.微粉预防高剂量组；PZ.普通粉治疗组；CZ.微粉治疗组；XZ.恩诺沙星治疗组。下同

2.6 血清中AST和ALT活性测定结果如图7可知，板蓝根微粉预防高剂量组AST低于模型差异显著(P<0.05)。板蓝根微粉预防中剂量组、板蓝根普通粉预防中剂量组AST低于模型组，差异极显著(P<0.01)。板蓝根普通粉预防中、低剂量组ALT低于模型组，差异显著(P<0.05)。板蓝根微粉治疗组、西药治疗组、板蓝根微粉预防高、中、低剂量组，ALT低于模型组，差异极显著(P<0.01)。

与空白组比较，△表示差异显著(P<0.05)，△△表示差异极显著(P<0.01)；与模型组比较，*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.7 肝脏中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素1(IL-1)含量测定结果由图8A可知，板蓝根微粉治疗组、西药治疗组的TNF-a低于模型组，差异显著(P<0.05)。板蓝根微粉预防高剂量组、板蓝根普通粉预防高剂量组TNF-a低于模型组，差异极显著(P<0.01)。由图8B可知，板蓝根微粉治疗组、板蓝根普通粉预防高剂量组中IL-1低于模型组，差异显著(P<0.05)。西药治疗组、板蓝根微粉预防高、中、低剂量组，IL-1低于模型组，差异极显著(P<0.01)。

图8 感染鸡白痢沙门菌的雏鸡肝脏中IL-1(A)和TNF-α(B)的含量

3 讨论

据报道,板蓝根微粉对雏鸡白痢沙门菌有很好的防治效果[14]。本试验体外抑菌结果显示，板蓝根微粉和普通粉相比，极大地提高抗菌活性，表明中药经过微粉碎后，生物利用度提高。扫描电镜和透射电镜发现经板蓝根微粉作用于鸡白痢沙门菌后，菌体的形态结构发生了变化，表明无论是板蓝根微粉还是普通粉都对鸡白痢沙门菌具有抑制作用，但板蓝根微粉对鸡白痢沙门菌的抑制作用优于板蓝根普通粉，表明板蓝根微粉化，提高其抗菌活性。

细菌致病性主要是其产生的毒素引起炎症，引发的动物机体全身免疫应答反应，板蓝根不仅具有抗菌活性，而且具有抗炎作用[15]。小鼠耳廓炎症试验表明，同剂量下板蓝根微粉比板蓝根普通粉起效快，说明板蓝根微粉中抗炎有效成分大量溶出，使药物的作用效果提高，起效速度更快。有研究表明板蓝根中多糖和水杨酸等成分具有抗炎作用[16-17]。前列腺素E2(PGE2)是目前研究最多的中枢正调节介质之一，中枢内的PGE2主要来源于脑血管内皮细胞及其周围的巨噬细胞。发热时下丘脑和脑脊液中cAMP浓度增高与体温升高呈显著正相关[18]。本试验检测了大鼠发热时下丘脑中cAMP含量的变化及板蓝根普通粉和微粉对此变化的影响，结果显示模型组下丘脑中cAMP含量明显升高，而板蓝根微粉高剂量组下丘脑中cAMP含量则明显低于板蓝根普通粉高剂量组，表明板蓝根微粉通过抗炎调低了下丘脑环磷酸腺苷(cAMP)和PGE2，从而达到解热作用。相比于普通粉，微粉高剂量组起效快。抗炎试验结果表面，板蓝根不仅具有抗菌作用，同时也具有抗炎作用，因此，尽管是板蓝根单味药，也体现出很好的临床疗效，具有很好的推广价值。

临床试验结果表明，板蓝根微粉和普通粉对鸡白痢沙门菌病具有一定的预防效果，能降低雏鸡的死亡率，且板蓝根微粉预防组优于板蓝根普通粉预防组，板蓝根微粉提高了药效，说明板蓝根通过微粉碎，活性成分的溶出率增加[19]，从而提高了临床疗效。但板蓝根微粉治疗组和板蓝根普通粉治疗组死亡率差异不明显。试验结果进一步说明，板蓝根的预防效果优于治疗效果。急性雏鸡沙门菌病以肝脏和肠道炎症为典型临床症状。当肝脏发生病变受到损伤时，ALT和AST就会从肝细胞进入血液，从而导致血液中ALT和AST活性明显升高[20]。板蓝根微粉预防各剂量组和普通粉预防各剂量组的ALT和AST均低于模型组，板蓝根微粉治疗组和普通粉治疗组的ALT和AST均低于模型组，提示板蓝根可以通过抗炎作用治疗由沙门菌引起雏鸡肝脏损伤。已有报道肠炎沙门菌感染鸡源巨噬细胞后，炎性因子 IL-1、IL-6、IL-1β、IL-18以及其他抗菌物质转录水平明显增加[21]。本试验结果表明，板蓝根微粉预防各剂量组和普通粉预防各剂量组的TNF-α和IL-1均低于模型组，板蓝根微粉治疗组和普通粉治疗组的TNF-α和IL-1均低于模型组。模型组TNF-α和IL-1含量高于空白组，说明机体受到致病菌感染后，TNF-α和IL-1含量会迅速升高，介导炎症反应，而用板蓝根预防和治疗都降低了TNF-α和IL-1含量，提示复方板蓝根微粉和普通粉均能抑制TNF-α和IL-1的分泌，减轻炎症反应，进而使机体免受沙门菌的侵害，对雏鸡机体起到一定的保护作用。

板蓝根微粉和普通粉均对鸡白痢沙门菌有一定的抑制作用，可有效预防雏鸡白痢沙门菌病，并能有效降低肝功指标和机体内炎性因子水平，减轻炎症反应，但板蓝根微粉效果优于普通粉。