云南省畜禽细菌耐药基因分布特征

李富祥，王慧辉，赵文华，高华峰，宋建领，王生奎，杨仕标*

(1.云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南农业大学 动物医学学院，云南 昆明 650201)

抗生素作为疾病预防和治疗药物以及生长促进剂被广泛应用于畜禽养殖行业，抗生素的长期超范围、超剂量应用导致畜禽耐药细菌和耐药基因产生和扩散，不仅大大增加了畜禽细菌病治疗的难度，而且畜禽耐药细菌可通过畜产品直接传播给人，畜禽细菌耐药基因也可通过细菌间的水平传播给人的致病菌[1]，给人类细菌病的防控也造成威胁，引发公共卫生问题。因此，开展畜禽细菌耐药基因分布特征研究对畜禽细菌病的防控和人类公共卫生具有重要意义。

目前，畜禽细菌耐药基因研究已受到国内外研究人员的广泛关注，已有大量关于畜群细菌耐药基因的研究报道，但绝大部分都是关于某一特定种类细菌的耐药基因研究报道[2-3]。也有少量关于肠道[4]、粪便[5]、污水[6]、土壤[7]等畜群养殖环境中菌群耐药基因的研究报道。未见我国从致病菌的角度，对来源于病死畜禽的多种潜在致病菌耐药基因的研究报道。本研究对来源于云南省昆明市、保山市、普洱市、红河州和楚雄州的病死畜禽中的大肠杆菌、肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和鸭源鸡杆菌等多种潜在致病菌94株，进行β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类和氯霉素类共23种耐药基因检测，分析耐药基因分布特征，以期为了解云南畜禽潜在致病菌耐药基因分布规律，为云南省畜禽养殖场兽医临床抗生素的科学应用和细菌耐药机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株94株细菌为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室2020年分离自云南省昆明市、保山市、普洱市、红河州和楚雄州的病死猪、牛、羊和鸡。包括大肠杆菌(Escherichiacoli) 19株、肠炎沙门菌(Salmonellaenterica)6株、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)6株、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)15株、鸭源鸡杆菌(Gallibacteriumanatis) 4株、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis) 9株、伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)9株、绵羊莫拉杆菌(Moraxellaovis) 3株、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 4株、猪链球菌(Streptococcussuis) 4株、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)6株、多动物链球菌(Streptococcuspluranimalium)5株和鼠口腔链球菌(Streptococcusorisratti)4株。全部菌株保存于云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室。

1.2 主要试剂营养琼脂购自北京奥博星生物技术有限公司；蛋白酶K和DL2000 DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物设计细菌耐药基因引物按参考文献[8-21]报道的引物序列设计，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列、退火温度及PCR产物片段大小见表1。

表1 耐药基因引物序列

1.4 耐药基因PCR检测

1.4.1DNA的提取 分别将94株细菌接种营养琼脂平板，37℃培养过夜，用灭菌超纯水将菌落洗脱下来制成菌悬液，用灭菌超纯水将菌悬液浓度调至约2.0×108CFU/mL，按照参考文献[22]介绍的煮沸法分别提取94株细菌的DNA作为PCR反应的模板。

1.4.2耐药基因的PCR检测 25.0 μL PCR反应体系：ddH2O 10.1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各0.2 μL，DNA模板2.0 μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30 s、各引物退火温度退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察检测结果。

1.5 畜禽耐药基因分布特征根据耐药基因检测结果，分析94株畜禽细菌中23种耐药基因的检出率以及各种多重耐药基因菌株的检出比例。

1.6 不同地区畜禽细菌耐药基因分布特征根据耐药基因检出结果，分析红河州(19株)、昆明市(22株)、保山市(21株)、普洱市(17株)和楚雄州(15株)5个不同地区畜禽细菌携带耐药基因种类和每株细菌平均携带耐药基因数量的差异。

1.7 不同畜禽种类细菌耐药基因分布特征根据耐药基因检出结果，分析猪(29株)、牛(9株)、羊(20株)和鸡(36株)4种不同动物细菌携带耐药基因的种类和每株细菌平均携带耐药基因数量的差异。

1.8 不同种类细菌耐药基因分布特征根据耐药基因检出结果，分析M.ovis(3株)、E.faecalis(6株)、E.coli(19株)、G.anatis(4株)、C.pseudotuberculosis(9株)、P.mirabilis(9株)、P.multocida(6株)、S.enterica(6株)、S.dysenteriae(15株)、S.aureus(4株)、S.suis(4株)、S.pluranimalium(5株)和S.orisratti(4株)耐药基因分布特征。

2 结果

2.1 畜禽细菌耐药基因检测及分布特征用23种耐药基因引物对94株畜禽细菌DNA样品进行检测，统计结果显示，23种耐药基因均有检出，其中aacA4(90.43%)检出率最高、其次是floR(87.23%)、tetA(80.85%)、qnrS(77.66%)、qnrD(74.47%)、tetM(71.28%)、sul2(69.15%)、aadA1(53.19%)、blaTEM(45.74%)、sul1(40.43%)、sul3(38.30%)、tetL(21.28%)、ermB(17.02%)、aadA2(14.89%)、tetB(13.83%)、ermA(10.64%)、qnrC(9.57%)、blaEBC(7.45%)、tetG(5.32%)、qnrB(4.26%)、blaCIT(3.19%)、ermC(3.19%)和blaCTXM(2.13%)。94株细菌均携带3种及以上耐药基因，其中携带8种及以上耐药基因数的菌株比例为73.40%(表2)，表明云南畜禽细菌携带耐药基因的种类和每株细菌平均携带耐药基因的数量均较多。

表2 云南省畜禽细菌携带耐药基因情况

2.2 不同地区畜禽细菌耐药基因分布特征统计结果显示，不同地区畜禽细菌耐药基因的种类存在差异：红河州畜禽细菌未检出blaCTXM、blaCIT、blaEBC、ermC和qnrB；昆明市畜禽细菌未检出ermA、ermB、ermC、tetB、tetG和qnrC；保山市畜禽细菌未检出blaCTXM、blaCIT和ermC。普洱市畜禽细菌未检出blaCTXM、blaCIT、ermB和qnrB；楚雄州畜禽细菌未检出blaCTXM、blaEBC、emrC、tetG、tetL、qnrB和qnrC；其他耐药基因在不同地区畜禽细菌中均有检出。不同地区畜禽细菌各菌株平均携带耐药基因数量存在差异，保山市畜禽细菌各菌株平均携带耐药基因数量(11.24种)最高，与其他地州畜禽细菌各菌株平均携带耐药基因数量之间差异较大；其他地州畜禽细菌各菌株平均携带耐药基因数量依次为：红河州>昆明市>普洱市>楚雄州，其间差异较小(7.53～9.11株)(图1)。

图1 不同地区畜禽细菌耐药基因分布

2.3 不同种类畜禽细菌种类耐药基因分布特征统计结果显示，猪、牛、羊和鸡细菌耐药基因检出种数分别为21种(仅blaCIT、blaEBC未检出)、15种(仅blaCTXM、aadA2、ermA、ermB、ermC、TetB、tetG和qnrC未检出)、18种(仅blaCTXM、blaCIT、blaEBC、ermC和qnrB未检出)和22种(仅ermC未检出)。不同畜禽种类细菌各菌株平均携带耐药基因数量存在差异，鸡细菌各菌株平均携带耐药基因数量(9.11种)最高，与牛、羊、猪细菌各菌株平均携带耐药基因数量之间差异较大(图2)；其他畜禽种类细菌各菌株平均携带耐药基因数量依次为：猪>牛>羊，其间差异较小(图2)。

图2 不同种类畜禽细菌耐药基因分布

2.4 不同种类细菌耐药基因分布特征统计结果显示，不同种类细菌携带耐药基因的种类存在差异，S.dysenteriae携带耐药基因种类(20.0种)最多，其次是S.suis(5.0种)、M.ovis(8.0种)和P.multocida(9.0种)，其他种类细菌携带耐药基因种类为11.0～17.0种。不同种类细菌各菌株平均携带耐药基因数量为3.5～11.0种(图3)，其中E.faecalis各菌株平均携带耐药基因数量(11.0种)最大(图3)，S.suis各菌株平均携带耐药基因数量(3.5种)最小(图3)。

图3 不同种类细菌耐药基因分布

3 讨论

耐药基因是细菌耐药性形成的重要因素，为了解云南畜禽潜在致病菌耐药基因分布状况，本研究首次从致病菌的角度，对来源于云南省5个不同地州、4种不同种类畜禽的13种潜在致病菌94株，进行β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类和氯霉素类共23种耐药基因检测。结果显示，23种耐药基因均有检出，其中aacA4、floR、tetA、qnrS、qnrD、tetM、sul2、aadA1、blaTEM、sul1、sul3、tetL共13种耐药基因的检出率均高于20.00%，是云南省畜禽细菌携带的主要耐药基因；94株细菌均携带3种及以上耐药基因，其中携带8种及以上耐药基因数的菌株比例为73.40%(表2)；表明云南畜禽细菌耐药基因的种类和每株细菌平均携带耐药基因的数量都较大，应引起足够的重视

耐药基因统计结果表明，云南不同种类畜禽细菌耐药基因的种类和数量存在差异，鸡细菌耐药基因的种类(22.00种)和每株细菌平均携带耐药基因数量(9.11种)均高于猪、牛和羊细菌耐药基因的种类(分别为21.00，15.00和18.00种)和每株细菌平均携带耐药基因数量(分别为8.17，7.89和7.75种)，可能是由于养鸡业频繁、大量使用β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类和氯霉素类抗生素有关。耐药基因统计结果还显示，不同地区畜禽细菌耐药基因的分布也存在差异，保山市畜禽细菌耐药基因的种类(20.00种)和每株细菌平均携带耐药基因数量(11.24种)均高于红河州、昆明市、普洱市和楚雄州畜禽细菌耐药基因的种类(分别为18.00，17.00，19.00和16.00种)和每株细菌平均携带耐药基因数量(分别为9.11，9.09，8.82和7.53种)，可能是由于该地区频繁、大量使用多种抗生素有关。

不同种类细菌耐药基因检测结果表明，E.faecalis检出blaTEM、aadA1、aacA4、sul1、sul2、sul3、ermA、ermB、tetA、tetL、tetM、floR、qnrC、qnrD和qnrS共15种耐药基因，其中ermA(66.67%)的检出率明显高于深圳(3.10%)[23]；ermB(83.33%)的检出率与深圳(64.70%)[23]和上海(95.50%)[24]一致；tetM(100.00%)检出率与顾欣等[24]报道的上海(91.00%)检出率一致。G.anatis检出blaTEM、aadA1、aacA4、sul1、sul2、sul3、ermA、ermB、tetA、tetB、tetM、floR、qnrC和qnrD，其中tetB(50.00%)检出率与BOJESEN等[25]报道的丹麦和墨西哥(55.10%)检出率高度一致；tetA(100.00%)、tetM(75.00%)的检出率与丹麦和墨西哥(均为0)[25]检出率差异很大；tetL(0)与丹麦和墨西哥(2.04%)[25]检出率不一致；其他耐药基因的检出均为国内外首次报道。P.multocida检出aadA1、aacA4、sul1、sul2、tetA、tetB、floR、qnrD和qnrS，其中sul1(100.00%)和sul2(100.00%)检出率与陈红梅等[26]报道的福建省、广东省和江西省鸭源P.multocidasul1(100.00%)和sul2(97.00%)检出率高度一致；floR(100.00%)检出率明显高于陈红梅等[27]报道的福建省、广东省和江西省禽源P.multocida(64.04%)检出率；floR、blaTEM(0)、aacA4(100.00%)和tetB(100.00%)阳性率与KHAC等[28]报道的越南猪源P.multocidafloR(6.00%)、blaTEM(7.20%)、aacA4(8.40%)和tetB(45.80%)的检出率差异都很大。C.pseudotuberculosis首次检出blaEBC、aadA1、aacA4、sul1、sul2、sul3、tetA、tetM、floR、qnrD和qnrS；C.pseudotuberculosis未检出blaTEM和blaCTXM，与王峰[29]报道的山西省blaTEM(92.86%)和blaCTXM(100.00%)检出率存在很大差异，表明我国不同地区blaTEM检出率差异很大。S.enterica检出blaTEM、blaEBC、aadA1、aacA4、sul1、sul2、tetA、tetG、tetL、tetM、floR、qnrB、qnrD和qnrS，其中blaTEM(100.00%)、tetA(83.33%)和sul1(33.33%)的检出率较高与陆彦等[30]报道的山东鸡S.entericablaTEM(88.00%)、tetA(82.80%)和sul1(33.33%)高度一致。S.suis检出aacA4、ermB、tetA、tetM和qnrD，其中ermB(100.00%)检出率与关琳等[31]报道的江苏省、广东省、山东省和上海市的检出率相同；tetM(100%)的检出率明显高于江苏省、广东省、山东省和上海市(6.67%)检出率；tetB未检出，而王治方等[32]报道的河南省检出率高达89.00%，两者差异很大。S.pluranimalium检出aadA1(20.00%)、aacA4(100.00%)、sul1(60.00%)、sul2(40.00%)、sul3(80.00%)、tetA(40.00%)、tetL(60.00%)、tetM(80.00%)、floR(100.00%)、qnrD(100.00%)和qnrS(100.00%)。S.orisratti检出blaTEM(25.00%)、aadA1(25.00%)、aacA4(100.00%)、sul2(50.00%)、sul3(50.00%)、ermB(75.00%)、tetA(75.00%)、tetL(100.00%)、tetM(75.00%)、floR(100.00%)、qnrD(100.00%)和qnrS(50.00%)。M.ovis检出aacA4(100%)、sul2(50.00%)、tetA(50.00%)、tetM(75.00%)、floR(50.00%)、qnrC(25.00%)、qnrD(75.00%)和qnrS(100.00%)。本研究首次报道S.pluranimalium、S.orisratti和M.ovis的耐药基因，对进一步研究其耐药基因分布特征和耐药机制具有重要意义。