猪白细胞介素-22分子特征的初步研究

李美娣，刘汉清，武 力，傅嘉莉

(1.广东华农高科生物药业有限公司，广东 广州 510642；2.华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

2000年，白细胞介素-22(interleukin-22,IL-22)首次在经过IL-9处理的BW5147鼠T淋巴瘤细胞中被发现[1]，属于IL-10家族的细胞因子，与IL-10家族其他细胞因子具有相似的蛋白质基序，通常参与保护性免疫，以预防炎症或自身免疫病[2-4]，也可以被类似的受体识别。目前，IL-22已确定由活化的先天淋巴样细胞(ILC)、CD4+T细胞、NK细胞、Th17细胞和DC细胞产生[5-9]。大部分哺乳动物IL-22已经被克隆成功，但目前还未见关于猪IL-22(poIL-22)的相关研究。本试验主要研究poIL-22的分子特征，为poIL-22的进一步研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞和猪样品pcDNATM3.1/myc-His (-) A购自Invitrogen公司；新鲜组织心脏、脑、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管、小肠、胃、背最长肌、脑、附睾，从长白猪中分离，液氮冷冻至RNA提取；RNAiso plus试剂盒、pMD-18T载体，购自上海生工生物有限公司；ReverTra Ace®qPCR RT Kit、KOD FX DNA聚合酶购自TOYOBO公司；HiPure Tissue DNA Kit购自Magen公司；胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；Endo-free Plasmid Kit购自Omega公司；引物序列，由上海生工生物有限公司合成，如表1所示。

表1 引物序列

1.2 总RNA分离和cDNA合成用RNAiso plus试剂盒提取猪组织中总RNA，按照RT-qPCR试剂盒进行cDNA合成，具体方法：将提取的总RNA在65℃下预热5 min，然后置于冰上，加入2 μL 5× RT buffer，0.5 μL RT Enzyme Mix，0.5 μL引物和无核酸酶的水，总体积为10.0 μL。将反应溶液在37℃下孵育30 min，98℃下加热5 min，并在-80℃下保存直至使用。

1.3 猪IL-22克隆用RT-qPCR试剂盒合成猪脑cDNA的第1链，使用KOD FX DNA聚合酶从大脑cDNA文库克隆poIL-22。RT-PCR反应体系包含：2.5 μL cDNA，10.0 μL 2×PCR buffer，0.4 mmol/L dNTP，引物IL22-F和IL22-R各0.3 μmol/L，0.5 U KOD FX。反应条件如下：94℃预变性2 min；98℃ 10 s，68℃ 30 s，共40个循环；最后68℃延伸10 min。通过1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，并将其克隆到pMD-18T载体中进行测序。

1.4 poIL-22的同源性比较和系统进化树构建在NCBI BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索与poIL-22序列相似的核酸和蛋白质序列，使用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)对poIL-22和其他物种IL-22进行同源性比较。使用带有成对删除选项的Nei-Gojobori方法计算进化差异和相似性百分比，并通过在分子进化遗传分析(MEGA)7.0软件(http：//www.megasoftware.net)中使用Bootstraps(1 000)计算来确认可重复性。然后使用MEGA 7.0进行了1 000个排列的mantel检验，以评估进化距离与种群相似性之间的相关性。

1.5 poIL-22序列分析通过GENSCAN程序(http://genes.mit.edu/GENSCAN)搜索poIL-22基因开放阅读框(ORF)，然后使用Expasy网站上的翻译工具(http://cn.expasy.org/tools/dna.html)确定poIL-22的氨基酸序列。使用ProtParam软件(http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)预测poIL-22的理化性质，包括相对分子质量、等电点、氨基酸组成、消光系数、半衰期和不稳定指数。使用TargetP程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)预测poIL-22的亚细胞位置。使用SignalP 4.1程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测poIL-22蛋白中的信号肽。使用Proscan(http://pbil.ibcp.fr)鉴定poIL-22蛋白中的蛋白基序。使用NetILos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和NetOGlyc 4.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc)鉴定poIL-22蛋白中包含的磷酸化位点和糖基化位点。

1.6 poIL-22结构建模通过Jpred 4服务器(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/index.html)预测poIL-22二级结构，此外，还通过ROBETTA服务器(蛋白质同源性/分析识别引擎)(http：//www.robetta.org)与人白介素22(PDB：3g9v)构建了poIL-22的三维(3D)结构。使用PROCHECK(http://services.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)检查3D结构，以评估立体化学和拓扑分析，并上传到Qmean服务器(http://swissmodel.expasy.org/qmean/cgi/index.cgi)，以评估蛋白质模型的质量并确定潜在的不可靠区域。然后可以通过PyMOL程序(www.pymol.org)可视化有用的模型，该程序还用于分析poIL-22中的二硫键结构域。

1.7 基因组结构测定和启动子分析使用HiPure Tissue DNA Kit分离了长白猪小肠组织的基因组DNA，将它们作为模板，以如下所述扩增poIL-22的基因组序列和5′侧翼区序列。首先，使用NCBI BLAST程序获得poIL-22的基因结构，并使用6对特异性引物(表1)以获得poIL-22的全长基因组序列。用引物IL22-pF和IL22-pR来扩增poIL-22 5′侧翼区序列的1 434 bp片段。使用KOD FX DNA聚合酶获得poIL-22的DNA序列。然后将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并克隆到pMD-18T载体中进行测序。

GENSCAN Web服务器(http://stanford.edu/～chis/GENSCAN.html)和Genomatix软件包(https://www.genomatix.de/index.html)中的Exon Mapper程序用于预测内含子-外显子的结构以及位于poIL-22基因组序列中的多腺苷酸化信号，由GT-AG规则确定[10]。通过Genomatix软件中的MatInspector程序和GPMiner程序(http://gpmi-ner.mbc.nctu.edu.tw/)分析poIL-22的启动子序列，以表征位于5′侧翼区域的转录结合位点。

1.8 组织分布分析通过RT-qPCR对猪各种组织的逆转录产物进行猪IL-22的表达分析。使用Primer Premier 5.0设计IL-22和ACTB的引物对(IL22-rF、IL22-rR和ACTB-rF、ACTB-rR)来扩增IL-22基因。RT-qPCR的反应条件：95℃预变性3 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环。通过循环阈值(Ct)鉴定每个RT-qPCR的拷贝数，并通过2-△△Ct计算组织中的差异表达。

1.9 真核表达载体的构建通过PCR将pMD18T-IL22中不含IL-22信号肽的编码序列克隆到哺乳动物表达质粒pcDNATM3.1/myc-His(-)A中，因该载体包含His标签和c-myc表位，后面可通过Western blot检测重组基因的表达，并通过镍柱亲和层析纯化重组蛋白。用含有NotⅠ和KpnⅠ酶切位点(序列下划线)的引物(IL22-cF和IL22-cR)扩增poIL-22，扩增的poIL-22片段和载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A均用内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切，酶切片段用胶回收试剂盒纯化回收，再用T4DNA连接酶进行连接，然后使用Endo-free plasmid Kit试剂提取构建好的重组质粒。

2 结果

2.1 poIL-22基因的克隆与特征分析用引物IL22-F和IL22-R克隆了poIL-22全长DNA片段，如图1所示。对重组质粒pMD18T-IL22进行了测序可知poIL-22 cDNA大小为765 bp(GenBank登录号KX588234)。通过使用ORF finder软件进行分析如图2所示，poIL-22的ORF框架为573 bp，(A+T)%=49.04%，(C+G)%=50.96%。翻译起始位点(ATG)位于26，TAG终止密码子位于598。通过BioEdit软件检测到poIL-22的蛋白质序列，其为191个氨基酸。

M.DL2000 DNA Marker;1.poIL-22

图2 poIL-22 cDNA的核苷酸和多肽序列

2.2 poIL-22基因的序列同源性比较如表2可见，poIL-22解链温度为84.92℃，(C+G)%为50.96%，将poIL-22 cDNA序列与来自各种物种的IL-22编码区的序列(CDS)进行比对，可见poIL-22的CDS与大多数大型陆生哺乳动物IL-22的序列相似性超过60.00%。

表2 IL-22序列参数

如表3可见，poIL-22与其他物种IL-22的相对分子质量、等电点、不稳定指数等具有高度的相似性，poIL-22中的负残基和正残基数基本在18～19之间，氨基酸脂肪族指数约100，平均亲水性(小于0)和不稳定性指数(约40)，脂肪族指数值可以直接说明蛋白质的结构稳定性，脂肪族指数越高则表明结构越稳定。因此，poIL-22和其他IL-22蛋白是稳定的蛋白。总体平均亲水度值小于0表示该蛋白质中包含许多亲水残基，该蛋白质可能是亲水性蛋白质。小于40的不稳定性指数表明poIL-22是一种稳定的蛋白质。在pH 7.0时，poIL-22的肽带电荷为6.95，为中性酸。

表3 IL-22氨基酸参数

2.3 poIL-22的结构和功能磷酸化位点是信号蛋白功能所必需的，也可能影响大多数细胞因子的活性状态[11]，糖基化是大多数真核细胞中常见的修饰反应，对于蛋白质的稳定性很重要[12]。如表4可见，poIL-22在功能域中包含8个磷酸化位点和3个糖基化位点(表3)。如图3可知，将poIL-22氨基酸序列上传到Proscan服务器以识别其功能域，可见其共享保守的IL-22结构域，氨基酸40～179。IL-22结构域由2对半胱氨酸，Cys40/Cys133、Cys90/Cys179组成。

蓝色块代表信号肽结构域，黄色块代表功能区；“N”和“C”字母代表蛋白质的左右末端；黑色突出显示的是保守的半胱氨酸

如图4A所示，poIL-22二级结构含有6个保守的序列结构位于α 螺旋处，在N端包含3条延伸链(β折叠)，在C端含有1条螺旋链。在图中，显示出6个保守的序列结构域位于α螺旋处。表4中的磷酸化位点和糖基化位点也大多位于α螺旋处。因此，Asn54(Helix A)和Asn98(Helix C)的糖基化位点可能对稳定poIL-22结构有用。序列和结构的相似表明poIL-22和poIL-10可能与具有共同区域的特定受体结合。图4B显示了人IL-22的3D结构模型，该模型证实了与IL-10中的受体相互作用的Helix A和Helix F可能含有与受体相互作用的残基[13-14]，先前的研究表明region 1(Asn21～Arg22)和region 6(Gly133～Glu134)中的位点在结合IL-10或IL-22受体中发挥了重要作用[15]。另外poIL-22还含有2对半胱氨酸(Cys)，它们形成了2个分子内二硫键：Cys6～Cys100和Cys57～Cys146(图4C)，2个键连接AE环和CF螺旋。二硫键的存在对于poIL-22的稳定性很重要，也有助于IL-22受体与poIL-22之间的特异性识别。

表4 poIL-22中预测的修饰位点 分数

A.poIL-22 和poIL-10的二级结构(绿色方块标记代表poIL-22的6个螺旋(helix)区域；黄色块标记代表poIL-10的6个helix和1个折叠)；B.人IL-22的3D结构模型(红色区域代表helix序列;黄色区域代表保守结构域);C.poIL-22的Cys及二硫键

2.4 系统发育树分析通过MEGA 7.0软件构建了poIL-22基因和其他物种IL-22基因之间的系统发育树，如图5所示，poIL-22基因与牛和绵羊的根系一致，与人和小鼠处于同一分支；与其他牲畜的IL-22在遗传上接近，与鱼类和家禽相距较远。

物种名称和GenBank登录号如下： Bos taurus(NM_001098379.1);Capra hircus(NM_001285758.1)1;Ovis aries(NM_001260478.1);Equus caballus(JL616449.1);Oryctolagus cuniculus(GBCK01073366.1);Homo sapiens(NM_020525.4);Macaca mulatta(NM_001194724.1);Mus musculus(NM_016971.2);Rattus norvegicus(NM_001191988.1);Gallus gallus(NM_001199614.1);Gadus morhua(FM207988.2);Dicentrarchus labrax(KJ818327.1);Oncorhynchus mykiss(NM_001164064.1);Scophthalmus maximus(JQ349070.1);Sparus aurata(JX976628.1);Xenopus tropicalis(NM_001142253.1);Danio rerio(NM_001020792.1)

2.5 poIL-22基因的基因组结构poIL-22基因的染色体位置和基因组结构如图6所示，通过BLAST程序将鉴定出的poIL-22 cDNA序列与猪基因组组装(Sscrofa 10.2)进行比较，结果显示，poIL-22 cDNA染色体的精确位置是猪5号染色体，poIL-22基因位于干扰素γ(IFN-γ)和线粒体分布与形态蛋白1(MDM1)之间，并靠近IFN-γ和IL-26。该研究还得出了poIL-22基因的5′侧翼序列和3′侧翼序列。并且图6中的3′侧翼序列显示poIL-22包含聚腺苷酸化信号(AATAAA)。

IL-26.白介素26； IFN-γ.干扰素γ； MDM1.线粒体分布和形态蛋白1;黑色方块.表示编码区域;带黑色圆圈的数字.表示外显子的数量;底部的序列.为poIL-22的3′侧翼序列;终止密码子和poly(A)尾部分别用红色和黑色标记

poIL-22的基因组与其他畜禽IL-22基因高度同源，如表5所示，猪与羊都是有5个外显子和4个内含子且大小相当，牛与马则有6个外显子和5个内含子，猪与羊的外显子2～5部分与牛与马的外显子3～6部分的结构相似，因此可以得出畜禽IL-22基因彼此具有相似的基因组结构。

表5 猪、牛、羊、马的肝脏中IL-22基因外显子内含子大小

2.6 poIL-22 mRNA表达的组织分布如图7所示，poIL-22可在组织中广泛分布，其中在皮肤和心脏的水平最高，其次是脾脏、小肠和脑，而在其他组织中的水平较低。这表明poIL-22主要参与黏膜免疫(皮肤和小肠)和心血管系统(心脏和大脑)的功能。

图7 poIL-22在组织分布情况

3 讨论

本研究成功克隆了一种新型的细胞因子poIL-22，并对其分子特征进行了研究，结果表明其相对分子质量约21 kDa，是一种稳定的亲水蛋白和碱性蛋白，其在皮肤、小肠、心脏、脑、脾脏等组织中也具有较高的水平。poIL-22基因与其它物种的IL-22一样，位于IFN-γ和IL-26基因座附近，也都具有高度保守的序列。

研究表明，IL-22在组织中的表达没有规律性。在低脊椎动物中，IL-22在鳕鱼腮中呈组成型表达，而在胆、性腺、头部和肾脏中表达水平很低[16]，但在鲻鱼中，它主要在肾脏中表达，在肝脏、肠和脾脏中很少见[17]。青蛙中IL-22的表达虽然表现出多种模式，但仅在肠和脾脏中可以检测到[18]。在哺乳动物中IL-22的分布也不固定。在小鼠中，IL-22主要在肾脏、心脏、胸腺和脑中检测到[1]。因此，IL-22的组织分布不稳定似乎表明IL-22在各种动物中没有固定的功能。如上所述，poIL-22在心血管系统，特别是胚胎期中，可能还具有免疫功能以外的功能。试验结果也表明了IL-22在黏膜免疫中的重要作用。在哺乳动物中，T细胞的种类(包括Th17细胞，γδ T细胞和NK T细胞)被确定为IL-22的主要表达形式[4,19]。因此，在胃肠道等黏膜中的高表达可能表明T细胞可以调节IL-22的稳态。虽然在人类或其他低等脊椎动物物种IL-22中已经报道了类似的结果，但在畜禽IL-22中仍然很少见。本试验结果显示poIL-22在猪各组织中均有表达，在黏膜组织皮肤和小肠中具有较高的表达量，在胸腺、肌肉、心脏、脑等也有很高的表达量，而在肝脏中表达量较低，这表明poIL-22可能主要对心血管系统和黏膜的功能发挥作用。

本试验研究表不仅可以为poIL-22作为免疫佐剂的使用提供可靠的证据，而且有助于了解IL-22对家畜的保护机制。