葛根素激活ERK1/2信号通路促进成骨细胞增殖

郑文静，陈智华，史冬雪,范希萍，韩晓梅,马 茜，赖 鑫

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

骨质疏松症是骨科常见疾病之一，临床表现为骨的微观结构疏松、薄弱、骨量下降为特征，导致骨脆性以及骨折患病率增加[1]。引起骨质疏松症发生的重要原因之一是大龄动物及绝育后动物机体内的雌激素含量减少，引起动物机体内破骨细胞分化水平增强进而导致骨质密度降低，骨吸收率、骨的消融率增加，出现骨钙沉积和不同程度骨质丢失等症状[2]。有关研究表明[3-5]，雌激素作为类固醇激素，可以通过激素受体调节途径，调节骨的增殖、分化和凋亡，对骨质生成和骨量的维持有着重要影响，但长期使用雌激素产生副作用会提升患乳腺肿瘤及心血管等疾病风险的概率。葛根素化学结构为4,7-二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮，是一种副作用极小的植物类雌激素，有着能与人体内的雌激素受体相结合增强成骨细胞的活性功能，进而抑制破骨细胞的分化，对骨质疏松症的预防和治疗有重要影响[6]。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路具有调控动物机体细胞的生长、分化及炎症反应等作用，也是成骨细胞增殖分化的主要信号通路，包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)3条信号通路[7-8]，其中，ERK1/2信号通路帮助提升成骨细胞ALP活性，刺激成骨细胞的细胞周期，是骨髓间质干细胞促进成骨细胞定向增殖、分化与成熟的重要信号通路[9-10]。现阶段葛根素通过ERK1/2信号通路机制对成骨细胞有增殖影响的研究较少，为此本研究拟在细胞水平以及分子水平上研究葛根素对MC3T3-E1细胞增殖所产生的作用，通过抑制MAPK信号通路中ERK1/2活性，观察MC3T3-E1细胞増殖过程中标志物及其蛋白的表达情况，探究葛根素对MC3T3-E1细胞的作用机制并阐明其间所涉及的信号通路，为葛根素防治骨质疏松提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株MC3T3-E1小鼠胚胎成骨前体细胞购自百慷生物技术股份有限公司。

1.2 主要试剂葛根素(PUE，浓度>98%)购自河南万佳首化生物科技有限公司；胎牛血清(LFBS)、胰酶消化液购自以色列B1公司；MEMα培养基(SH30265.01)购自美国Hyclone公司；SCH772984(ERK1/2信号通路抑制剂)、二甲基亚砜(DMSO 纯度99.5%)、pNPP试剂盒、CCK-8试剂盒、蛋白裂解液均购自上海碧云天生物技术有限公司；PBS缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.2～7.4)、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自(武汉，BOSTER生物)；Ⅰ型胶原ELISA试剂盒购自江苏宝莱生物科技有限公司；GAPDH一抗购自美国proteintech公司；p-ERK1/2一抗购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 试剂配制细胞培养基制备：100 mL细胞培养液(89 mL MEMα细胞培养液+10 mL FBS+1 mL 双抗(青霉素-链霉素)。

葛根素浓度梯度溶液配制：取20 μL DMSO加入20 mg葛根素与180 μL的细胞培养基混匀，使浓度稀释为10-2mol/L。从浓度为10-2mol/L的溶液中吸取0.55 mL液体，混合于4.95 mL的细胞培养基中,终浓度为10-3mol/L；以此类推配制浓度为10-4，10-5，10-6，10-7mol/L的4组药物。

1.4 细胞培养MC3T3-E1细胞复苏(水浴恒温锅，37℃)，复苏好的MC3T3-E1细胞液移入离心管中，离心(1 000 r/min，10 min)。离心后弃上清液，加入培养液接种于细胞瓶中，置于培养箱中(37℃、5% CO2)培养。

1.5 CCK-8试剂盒测定各浓度梯度葛根素对MC3T3-E1细胞活力取生长稳定的MC3T3-E1细胞，PBS洗2次，加入0.25%胰酶消化成细胞悬液，调整细胞密度为2×104个/mL。滴加100 μL细胞悬液于96孔板中，于细胞悬液周围加入PBS溶液，待细胞贴壁后，96孔板中添加不同浓度梯度葛根素培养(24 h)。取出96孔板，将10 μL的CCK-8溶液加入各孔中，置细胞培养箱中培养(37℃,3 h),在450 nm的条件下测各孔吸光度值，做6组重复试验，筛选出葛根素促进细胞增殖的最佳浓度。

选取葛根素的最佳浓度加入MC3T3-E1细胞液中继续培养，CCK-8试剂盒分别检测培养24，36，48和60 h时间段的细胞活力，记录450 nm的条件下测各孔吸光度值，筛选出MC3T3-E1细胞增殖的最佳作用时间。

1.6 pNPP法检测各浓度梯度葛根素对MC3T3-E1细胞ALP的活性在96孔板中加入不同浓度梯度的葛根素细胞培养液(同1.5)100 μL，用PBS溶液洗涤细胞2次，加入75 μL RIPA裂解液，将显色底物充分溶解于检测缓冲液中,置恒温箱孵育(37℃,30 min)， 终止反应(添加反应终止液100 μL)后，在450 nm的条件下测定吸光度值，D值高代表细胞ALP活性强。

1.7 葛根素激活ERK1/2信号通路对MC3T3-E1细胞的影响

1.7.1CCK-8试剂盒测定细胞增殖活力 细胞培养步骤同1.4。滴加100 μL细胞悬液于96孔板中，于细胞悬液周围加入PBS溶液，细胞贴壁后弃废液，在96孔板加入培养液，将试验分为空白组(细胞培养液)、葛根素组(浓度为10-6mol/L葛根素细胞培养液)、葛根素+ERK1/2抑制剂组(含ERK1/2通路抑制剂SCH772984的10-6mol/L葛根素细胞培养液)，培养48 h,每孔加入CCK-8溶液10 μL，细胞培养箱中孵育3 h，酶标仪上标注450 nm波长，测定各孔吸光值。

1.7.2pNPP法测定细胞ALP活性 细胞培养步骤同1.4；其余操作步骤同1.6。

1.7.3Western blot检测P-ERK1/2蛋白 提取空白组、葛根素组、葛根素+ERK1/2抑制剂组总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。将空白组、葛根素组、葛根素+ERK1/2抑制剂组与4×蛋白上样缓冲液按照3∶1的比例配置蛋白工作液。置该蛋白于金属浴煮沸变性(100℃，10 min),制备SDS(聚丙烯酰氨凝胶电泳)，进行电泳分离，再将蛋白转至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜， BSA溶液封闭，摇床室温封闭3 h。一抗4℃过夜，PBST清洗6次，每次10 min，添加二抗，室温孵育1 h，PBST 清洗6次，每次10 min，滴加化学曝光液曝光，并用ImageJ软件进行蛋白条带图像分析，计算相对表达量。

1.7.4ELISA检测Ⅰ型胶原蛋白含量 应用双抗体夹心法测定标本中的Ⅰ型胶原水平。不同分组的细胞样品加入酶标板孔底部，37℃温箱30 min，弃废液，甩干后洗涤，静置30 s后弃掉，重复5次，拍干。除空白孔外，酶标孔中添加酶标试剂50 μL，室温孵育30 min，洗涤5次，将显色剂按顺序添加到酶标板中，混匀，37℃温箱避光显色10 min，终止反应，酶标仪测定波长为450 nm时的吸光度值。

2 结果

2.1 CCK-8、pNPP法检测各浓度梯度葛根素对MC3T3-E1细胞增殖分化通过CCK-8试剂盒，pNPP法检测结果发现，当各浓度梯度葛根素组对比空白对照组时，浓度为10-7～10-4mol/L葛根素组测出的D值均较高(0.01≤P<0.05)，其中浓度为10-6mol/L葛根素组的D值排第1(表1)，表明浓度为10-7～10-4mol/L的葛根素都能促进MC-3T3-E1细胞增殖分化，在浓度为10-6mol/L时促进细胞增殖分化作用更为显著(0.01≤P<0.05)；与之相反，10-3mol/L的葛根素促进该细胞增殖分化作用较弱，因此浓度越高，促进MC3T3-E1细胞增殖分化能力越弱。

表1 CCK-8、pNPP法检测细胞增殖分化的结果

根据表1结果，10-6mol/L的葛根素是促进细胞增殖分化的最适浓度，用该浓度葛根素作用于MC3T3-E1细胞培养(24，36，48，60 h)。CCK-8法检测该不同时间段细胞增殖情况，记录D值(450 nm)，结果见图1，浓度为10-6mol/L的葛根素在48 h的D值最高，表明10-6mol/L葛根素在48 h对MC3T3-E1促进细胞增殖作用最显著，选择此最佳作用时间进行葛根素激活ERK1/2信号通路中的相关试验。

不同字母表差异显著(0.01≤P<0.05)，相同字母表差异不显著(P≥0.05)。下同

2.2 葛根素激活ERK1/2信号通路对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响将试验分为空白对照组(NC)、葛根素组(PUE)和葛根素+ERK1/2抑制剂组(PUE+SCH772984)，分别作用于MC3T3-E1细胞，CCK-8试剂盒、pNPP法检测细胞活力和碱性磷酸酶活性情况(D450 nm、D405 nm),结果如表2所示。葛根素组与空白组相比D值均升高，表明葛根素组促进MC3T3-E1细胞增殖分化作用显著(0.01≤P<0.05)；葛根素组与葛根素+ERK1/2信号通路抑制剂组相比，加入信号通路抑制剂的D值显著降低，表明葛根素可以通过激活ERK1/2信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖分化。

表2 CCK-8、pNPP法检测细胞增殖分化的结果

ELISA检测Ⅰ型胶原活性：将96孔板从培养箱中取出，取细胞样对应加入ELISA微孔板，采用双抗体夹心法，检测Ⅰ型胶原蛋白的分泌水平。结果如表3所示，与空白组相比，葛根素组促进MC3T3-E1细胞分泌Ⅰ型胶原作用显著(0.01 ≤P<0.05)；与葛根素组相比，葛根素+ERK1/2信号通路抑制剂组能够明显抑制MC3T3-E1细胞分泌Ⅰ型胶原。表明葛根素可以通过激活ERK1/2信号通路增强MC3T3-E1细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的能力，从而促进MC3T3-E1细胞分化。

表3 ELISA检测MC3T3-E1细胞分泌Ⅰ型胶原 D450 nm

2.3 葛根素对p-ERK1/2蛋白表达的影响进一步分析葛根素通过ERK1/2通路促进成骨细胞分化潜在机制，提取每个试验组蛋白，按Western blot试验步骤进行操作可得出p-ERK1/2磷酸化蛋白的表达水平的情况，进行灰度数据分析。结果如图2所示。与空白组相比，葛根素组ERK1/2磷酸化蛋白的表达显著上升。与葛根素组相比，葛根素+ERK1/2信号通路抑制剂组对磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)的表达有明显抑制作用。说明葛根素可以通过ERK1/2信号通路介导提升MC3T3-E1细胞的增殖情况。

图2 葛根素与MAPK信号通路抑制剂对ERK1/2信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

骨质疏松的研究一直是骨组织工程领域中最热门的课题之一，抑制成骨细胞增殖分化是骨质疏松症的主要致病机理[11]。目前首要的治疗方法通过雌激素代替疗法，促进成骨细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白、ALP等骨形成因子，加强成骨细胞形成骨基质，因此雌性激素缺乏，更易诱发骨质疏松症[12]。葛根素与雌激素化学结构类似，可以抑制激素缺乏引起的骨丢失而且不增加雌激素样的副作用[13-14]，因此开展探寻葛根素在骨代谢调节过程中的角色以及对骨髓的间质干细胞影响成为研究领域的新型课题，王昌等[15]发现葛根素不仅能加快 Wistar 新生小鼠颅盖骨成骨细胞的增殖分化并且在抑制自体骨吸收方面起着重要作用； 孙玉敏等[16]研究表明葛根素对患有骨质疏松老年病人的成骨细胞有明显防治作用。本试验拟在细胞水平和分子水平上研究不同浓度葛根素对MC3T3-E1细胞的增殖分化及其机制。MC-3T3-E1细胞是乳鼠源性胚胎前体细胞，该细胞ALP表达显著且与成骨细胞特性相似，成为研究骨质疏松症的种子细胞。试验结果显示，10-7～10-4mol/L 的葛根素对MC3T3-E1细胞有着不同程度的增殖分化影响，当葛根素浓度为10-6mol/L，作用48 h时，对MC3T3-E1细胞增殖、分化的作用最为明显，但是当葛根素浓度大于10-4mol/L时，使MC3T3-E1细胞增殖、分化能力降低。这对于防治骨质疏松症有重要意义。

细胞外调节激酶(ERK)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路广泛存在于哺乳动物细胞内，在成骨调节中起重要作用[17]。当细胞受到细胞外刺激时通过Raf-MEK1/2-ERK1/2激酶联合将丝裂原信号从细胞浆膜传到细胞核，活化MEK1/2，磷酸化ERK1/2参与成骨调控[18]细胞分化的重要标志是成骨细胞增殖早期分泌的碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原，这可来判断成骨细胞的分化能力[19-20]。丁道芳等[21]在通过抑制 MAPK(ERK1/2)信号通路调节成骨细胞活性的试验中证实，Ⅰ型胶原、成骨性基因Runx2和ALP的表达程度会随着干扰ERK1/2信号通路后逐渐下调，证实ERK1/2信号通路的激活能够增强成骨基因表达促使成骨细胞增殖。本试验研究结果发现，葛根素组与空白组相比，10-6mol/L葛根素组MC3T3-E1细胞增殖作用和碱性磷酸酶活性升高，Ⅰ型胶原及p-ERK1/2蛋白表达显著上升；而干扰ERK1/2通路表达后，葛根素+ERK1/2信号通路抑制剂组MC3T3-E1细胞增殖作用和碱性磷酸酶活性下降，Ⅰ型胶原及p-ERK1/2蛋白表达显著降低，表明葛根素在调控体外MC3T3-E1细胞的增殖分化过程中，ERK1/2通路发挥了正向调控作用，从而使MC3T3-E1细胞增殖分化。

以上结论可得出，葛根素通过ERK1/2信号通路介导刺激MC3T3-E1成骨细胞周期提升分泌ALP和Ⅰ型胶原的能力，从而促进MC3T3-E1细胞增殖分化，但其机理可能是多方向的，还需要进一步研究。