多房棘球绦虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

王冰洁，赵 莉，班万里，段兰利，郭 璐，陈云英，余婉蓉，张壮志*

(1.新疆畜牧科学院 兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，新疆 乌鲁木齐 830013；2.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

由泡球蚴(多房棘球绦虫的幼虫)寄生于动物或人体内而致的多房棘球蚴病又称泡型包虫病(alveolar echinococcosis，AE)，是重要的人畜共患寄生虫病。泡球蚴早期寄生于中间宿主的肝脏内，导致局部肝脏组织病变乃至坏死，而无明显临床症状；晚期似肝癌样转移至肺脏、脑、乳腺等脏器而被称为“虫癌”，若不及时治疗，10年病死率高达94%[1]，因此AE已成为人类致死率最高的慢性感染性疾病之一[2]。AE主要分布于北半球，呈局部地方性流行[3]，在我国主要分布于新疆、青海、西藏等西部牧区和半农牧区[4]。由于我国西部牧区野生狐狸、放牧犬和啮齿类动物分布广泛，使得多房棘球绦虫生活史存在复杂性，进一步增加了宿主动物和人传播和感染该病的风险[5]。因此及时、准确地监测AE，对控制该病的流行、综合防控措施的实施和防制效果的评价等都具有十分重要的意义。

目前主要使用B超、CT、X射线和磁共振(MRI)等[6-9]影像学方法以及酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质印迹(Western blot)等[10]免疫学方法对该病进行检测。影像学检查时，AE的一些非典型和体积较小的病灶常与肝癌和肝脓肿等相混淆[11]，免疫学检测则因使用粗抗原而导致特异性较差，因此开发高度敏感、特异检测AE的方法是控制该病的一种切实有效的方法，并且在使用方面具有广阔的应用前景。本研究以多房棘球绦虫NADH3基因的特异性引物和探针建立起了用于AE检测的荧光定量PCR方法，可为该病的快速检测、疫情监测及流行病学调查提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 虫株及临床样本多房棘球蚴(Echinococcusalveolar)、多房棘球绦虫(E.m)、细粒棘球蚴(Echinococcuscystic)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，E.g)、脑多头蚴(Coenuruscerebralis，C.c)、多头多头绦虫(Multicepsmulticeps，M.m)、细颈囊尾蚴(Cysticercustenuicollis，C.t)、泡状带绦虫(Taeniahydatigena，T.h)及犬弓首蛔虫(Toxocaracanis，T.c)虫株均由本实验室分离保存。多房棘球蚴和E.m临床样本(鼠肝包囊、狐狸肠道寄生虫体)由本实验室在伊犁昭苏县采集，样本详细信息见表1。

表1 临床样本信息

1.2 主要试剂琼脂糖；2×SuperReal PreMix(Probe)；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)；GoldenViewTM核酸染料；DL2000 DNA Marker；2×Taq PCR MasterMix；Taq DNA聚合酶；pMD19-T载体；胶回收试剂盒；质粒小量提取试剂盒等均购自北京天根科技有限公司。

1.3 引物及探针的设计与合成针对E.mNADH3基因保守区，使用Oligo 6.0软件设计特异性引物和探针：Em-F：5′-GCAGGTTACTTTGATATAGTAAATTGTG-3′；Em-R：5′-CCAGA-ATTAAAAAAATAAATAAC-3′；Em-P：5′-(VIC)ATTTTGACTCATATATCTAATGTTGCGAAGAGCT(TAMRA)-3′，并由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.4 重组质粒标准品的制备E.m阳性样本提取DNA后进行常规PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，25个循环；最后72℃延伸10 min，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的片段并与pMD19-T载体进行连接，转化大肠杆菌感受态(DH5α)，筛选阳性菌落并扩大培养，抽提质粒，进行PCR鉴定、测序及序列分析，根据序列分析结果选择正确的重组质粒作为标准品，测定重组质粒的浓度，并换算成拷贝数。

1.5 反应体系及条件优化通过矩阵法筛选反应体系中引物和探针的最适浓度组合，并确定PCR反应的退火-延伸温度、反应时间及循环数。

1.6 标准曲线的建立及敏感性试验将计算出拷贝数的重组质粒标准品进行10倍梯度稀释，得到109～100拷贝/μL共10个稀释度的质粒模板，每个稀释度做3个复孔，建立荧光定量PCR标准曲线并确定该方法的最低检出限。

1.7 特异性试验按照建立的荧光定量PCR检测方法对提取的E.m、E.g、C.c、M.m、C.t、T.h及T.c阳性样本DNA进行检测，判定该方法的特异性。

1.8 重复性试验选取107～103拷贝/μL的标准品进行重复检测，比较同一浓度梯度的标准品在重复检测中的扩增曲线与Ct值之间有无明显差异并进行统计学分析，确定该方法的稳定性。

1.9 临床样本的检测应用建立的荧光定量PCR方法和常规PCR方法[12]对从伊犁昭苏县采集的50份疑似感染多房棘球蚴或E.m的临床样本(表1)进行检测，比较两者的敏感性和符合率。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的鉴定提取的质粒经PCR扩增，得到长度约为189 bp的目的片段(图1)，测序比对后确定为多房棘球绦虫NADH3基因，表明标准阳性重组质粒构建成功，命名为pMD19-T-Em，质粒质量浓度经测定为132 mg/L。

M.DL2000 DNA Marker；1.重组质粒的PCR产物；2.阴性对照

2.2 反应体系及条件优化结果优化后，确定最佳反应体系为(20.00 μL)：2×SuperReal PreMix(Probe)10.00 μL，上、下游引物(10.00 μmoL)各0.50 μL，探针(10 μmoL)0.25 μL，模板DNA 1.00 μL，灭菌ddH2O 7.75 μL。最佳反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，40个循环，同时收集荧光信号。

2.3 标准曲线及敏感性试验结果以109～100拷贝/μL的重组质粒标准品为模板进行荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线(图2)和标准曲线(图3)。可以看出建立的方法可以检测出的标准品最低浓度为10 拷贝/μL，建立的标准曲线相关系数R2=0.998，表明建立的方法灵敏度高、误差小。

1～10.109～100 拷贝/μL；11.阴性对照

图3 E.m实时荧光定量PCR的标准曲线

2.4 特异性试验结果以E.m、E.g、C.c、M.m、C.t、T.h及T.c阳性样本DNA为模板，分别进行荧光定量PCR扩增，只有多房棘球蚴和E.m出现良好的扩增曲线(图4)，表明建立的方法特异性较好。

1.多房棘球蚴；2.E.m标准质粒(107 拷贝/μL)；3.多房棘球绦虫；4.细粒棘球蚴；5.细粒棘球绦虫；6.脑多头蚴；7.多头多头绦虫；8.细颈囊尾蚴；9.泡状带绦虫；10.犬弓首蛔虫；11.阴性对照

2.5 重复性试验结果用107～103拷贝/μL的标准品进行的组内和组间重复性试验，变异系数均小于3%(表2)，表明建立的方法重复性和稳定性较好。

2.6 临床样品检测结果对采集自伊犁昭苏县的50份疑似感染多房棘球蚴或E.m的临床样本(表1)分别用荧光定量PCR方法和常规PCR方法进行检测，荧光定量PCR检测的阳性率为18%(9/50)，常规PCR为14%(7/50)，两者阳性符合率为100%。

3 讨论

AE为自然疫源性疾病，野生动物参与其循环链。在中国境内传播该病的中间宿主主要包括部分鼠类在内的小型哺乳动物，终末宿主有狼、狐狸、犬等[5]，传播宿主种类较为复杂。AE感染潜伏期长，从感染至发病一般为10～15年[2]，现有诊断技术还不足以发现早期感染[13]，而常用的组织形态学、影像学及血清免疫学在有些情况很难区分是否为AE感染，分子生物学检测则解决了这一问题[14]。科研人员经过多年的不断探索，已将基因扩增和核酸杂交技术用于包虫病病原的检测，方法主要包括Southern杂交(Southern blot)、聚合酶链式反应(PCR)、PCR+限制性片段长度多态性(PCR+RFLP)、实时定量PCR(Real-time PCR)和环介导恒温扩增技术(LAMP)等[15-20]。Real-time PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的一种对模板进行定量分析的PCR技术，以其敏感特异、快速高效等突出特点，可用于E.m的流行病学调查[21]。目前荧光定量PCR方法主要包括染料法(如：SYBR Green染料)和探针法(如TaqMan和MGB探针等)，虽然染料法成本比探针法低，但探针法特异性好，在临床检测中有着突出优势[22-23]。

因此，本研究基于E.mNADH3基因保守区设计了特异性引物和TaqMan探针，建立了用于检测该病的荧光定量PCR方法。该方法获得的标准曲线线性关系好，在109～101拷贝/μL相关系数达0.998，灵敏度达10拷贝/μL，与其他病原(E.g、C.c、M.m、C.t、T.h、T.c)不存在交叉反应，组内和组间变异系数较小(<3%)，说明该方法灵敏度高，特异性强，重复性和稳定性好。在临床样品检测试验中，能成功地检测出E.m，且与普通PCR方法相比，检出率明显提高，检测时间明显缩短，说明本研究建立的方法可以对AE病原进行检测，及时发现传染源，对该病的防控具有重要意义。