GC-MS-AMDIS结合保留指数在玫瑰花露香气成分准确定性分析中的应用

雷春妮，王 波，孙苗苗，代 路

(兰州海关技术中心，甘肃 兰州 730010)

气相色谱-质谱数据的定性主要依赖谱库匹配。由于低分辨质谱中的杂质、噪声与共流出物的影响，对目标物定性时会出现同一质谱图具有多个高匹配度的化合物与之对应，或出现匹配度相近、匹配度极低等现象，使目标物准确定性困难，甚至会导致定性错误[1-2]。自动质谱退卷积定性系统(automated mass spectral deconvolution and identification system, AMDIS)能够对总离子流图进行自动解卷积处理，推测共流出离子碎片的归属，可提取未知组分更“纯净”的质谱图，对低浓度物质的峰、背景较复杂的峰和重叠峰有较强的分辨解析能力，使定性结果更准确[3]。目前，AMDIS法已被用于山茱萸、阿胶等天然产物挥发性化合物的定性分析[4-7]。

玫瑰花可用来提取玫瑰精油，为了综合利用玫瑰花资源，提高玫瑰花的附加值，近年来出现了玫瑰花水和玫瑰鲜花细胞液等产品。玫瑰花水是玫瑰精油在蒸馏萃取过程中产生的一种副产品，含有微量的玫瑰精油成分，适量的玫瑰花水具有抗衰老的功效；玫瑰鲜花细胞液是玫瑰鲜花细胞中的挥发性物质在低温条件下冷凝而成的液体，具有玫瑰鲜花的自然花香。本研究将玫瑰花水和玫瑰鲜花细胞液均称为“玫瑰花露”。目前，国内外没有玫瑰花露相关的加工工艺标准及产品的行业和国家标准，玫瑰花露生产工艺不尽合理，使玫瑰花露产品质量参差不齐。关于玫瑰产品的研究主要集中在玫瑰精油方面[8-10]，尚未见到对玫瑰花水和玫瑰鲜花细胞液香气成分差异的研究报道。

本研究拟采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)分析玫瑰花露的香气成分，利用自动质谱退卷积定性系统结合NIST14谱库检索和保留指数，对检测到的香气成分进行定性鉴别，以期为天然产物香气成分的分析研究提供方法借鉴，为玫瑰花露香气品质评价提供理论依据。

1 实验部分

1.1 装置与材料

Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司产品；7 μm PDMS、60 μm PEG、65 μm PDMS/DVB、75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm Polyacrylate固相萃取头：美国Supelco公司产品；磁力搅拌仪：美国TALBOYS公司产品；NIST14标准质谱库、AMDIS Version 2.72：美国国家标准技术研究所产品。

玫瑰花露样品：甘肃皓思玫瑰制品有限公司产品；正构烷烃混合标准品(C7～C40)：美国O2si公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1顶空固相微萃取 取10.0 mL玫瑰花露试样于40 mL顶空瓶，加入磁力搅拌子和1.0 g氯化钠，封盖摇匀，置于磁力搅拌仪上加热(温度40 ℃，速度1 500 r/min)，40 ℃平衡20 min，将已活化好的萃取头插入顶空瓶中，在40 ℃下萃取40 min，萃取完成后，将萃取头于气相色谱-质谱仪解吸7 min。

1.2.2气相色谱条件 HP-INNOWAX色谱柱(60 m×0.250 mm×0.5 μm)；程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至180 ℃，再以20 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)；进样口温度250 ℃；分流比为10∶1。

1.2.3质谱条件 电子轰击离子源；电子能量70 eV；MS传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；全扫描模式采样；质量扫描范围m/z25～500。

2 结果与讨论

2.1 顶空固相微萃取条件优化

以苦水玫瑰花水为研究对象，比较不同固相萃取头、样品量、磁力搅拌方式、氯化钠含量、萃取温度、平衡时间、萃取时间对玫瑰花露香气组分萃取效果的影响。峰面积表示萃取香气组分的含量，出峰数表示萃取香气组分的种类[11]，所以选择总峰面积和峰数目2个指标考察各因素的萃取效果，优化HS-SPME法萃取玫瑰花露挥发性成分的条件。

2.1.1固相萃取头的优选 固相微萃取的萃取效果在很大程度上取决于目标物在样品和纤维头涂层材料之间的分配系数，不同纤维涂层对挥发性成分吸附能力有所差别。本实验考察了7 μm PDMS、60 μm PEG、65 μm PDMS/DVB、75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm Polyacrylate等7种萃取头对玫瑰花水香气组分的萃取效率，示于图1。结果表明，7 μm PDMS、60 μm PEG、65 μm PDMS/DVB萃取头总峰面积明显低于其他4种萃取头，75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、85 μm Polyacrylate萃取头总峰面积基本相当，而50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头总峰面积略高；75 μm Carboxen/PDMS萃取头总峰数明显高于其他6种萃取头。此外，75 μm Carboxen/PDMS萃取头在40 min之前的出峰个数高于50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，表明75 μm Carboxen/PDMS萃取头对玫瑰花水轻组分香气成分富集效果较好。综合考虑，选择75 μm Carboxen/PDMS萃取头。

图1 不同固相萃取头的优选Fig.1 Optimization of different solid phase extraction heads

2.1.2样品量优选 样品量太少会导致吸附目标物的量少，样品量过大则会导致顶空体积变小，影响吸附效果。本实验考察了5、10、15、20、25 mL不同样品体积对玫瑰花水香气成分萃取效果的影响，示于图2。样品体积为10 mL时，总峰面积和总峰数均达到最大值，之后随着样品体积增大，总峰面积和总峰数呈减小的趋势。这可能是由于样品量过大，顶空体积变小，影响吸附效果，也可能是由于样品量过大使萃取头饱和，不利于萃取。所以，选择10 mL为样品最优体积。

图2 不同样品量的优选Fig.2 Optimization of different sample amounts

2.1.3磁力搅拌优选 本实验考察了磁力搅拌对玫瑰花水挥发性香气成分萃取效果的影响，示于图3。经过磁力搅拌后的玫瑰花水香气成分的总峰面积比未搅拌的大，但是相对含量较高的化合物峰面积变化不大。这表明在玫瑰花水中，某些低含量或者低挥发性的成分可以通过磁力搅拌促进挥发，进而被萃取头吸附。因此，实验选择磁力搅拌的方式。

图3 搅拌方式的优选Fig.3 Optimization of stirring modes

2.1.4氯化钠含量优选 NaCl作为一种电解质，可以促进一些待测物质挥发，提高萃取头对香气成分的萃取效率。本实验考察了0、1.0、2.0、3.0 g NaCl含量对玫瑰花水香气成分萃取效果的影响，示于图4。当NaCl含量为1.0 g时，总峰面积和总峰数均达到最大值，之后则均呈下降趋势。这可能由于NaCl作为一种无机盐易溶于水相，而玫瑰花水残留少量玫瑰精油，随着 NaCl含量的增加，油相限制了NaCl对玫瑰花水香气物质的萃取，因此添加1.0 g NaCl为宜。

图4 不同氯化钠含量的优选Fig.4 Optimization of different sodium chloride contents

2.1.5平衡时间优选 平衡时间即加热时间，是样品中的香气成分在气相中达到平衡所需要的时间。随着平衡时间的延长，香气成分的总峰面积呈下降趋势，当平衡时间为 10 min 时，总峰面积就已达到较大值，示于图5。香气成分的总峰数呈先上升后下降的趋势，当平衡时间为20 min 时，总峰数达到较大值，表明此时已经基本达到平衡状态。综合考虑，选择平衡时间20 min为最优。

图5 不同平衡时间的优选Fig.5 Optimization of different balance time

2.1.6萃取温度优选 萃取效果受萃取温度影响明显，温度过低，可能导致样品中某些组分无法挥发出来，造成挥发不完全；温度过高，可能造成挥发性成分之间发生化学反应，导致分析结果失真[12]。本实验考察室温、30、40、50、60、70 ℃萃取温度对峰面积的影响，示于图6。随着萃取温度的升高，总峰面积和总峰数呈先增大后减小的趋势，在40 ℃时达到最大值，分别为1.58×1010和272个。这可能是由于温度升高后加快了分子运动速率，使目标物更易被富集吸附，导致出现总峰面积和总峰数都增大的现象，但温度过高，低沸点组分在竞争吸附中处于劣势，造成部分流失[11]。因此，选择40 ℃为较优萃取温度。

图6 不同萃取温度的优选Fig.6 Optimization of different extraction temperatures

2.1.7萃取时间优选 萃取时间可以影响顶空和萃取头纤维涂层之间分析物的平衡，当萃取时间不足时，香气组分吸附不充分；萃取时间过长时，已被吸附的组分可能出现脱附现象，造成峰数减少[13]。本实验考察20、30、40、50、60 min萃取时间对峰面积的影响，示于图7。随着萃取时间的延长，挥发性成分的总峰面积和峰数目不断增大，当萃取时间超过40 min时，变化不明显。考虑到萃取效率，选择40 min 萃取时间为最优。

图7 不同萃取时间的优选Fig.7 Optimization of different extraction time

2.2 玫瑰花露香气组分分析

富集玫瑰花露香气获得的总离子流图示于图8。采用 AMDIS对色谱峰纯化，通过谱库检索结合保留指数辅助定性，面积归一化法相对定量，结果列于表1。

表1 玫瑰花露香气成分的鉴定结果及相对含量Table 1 Identification results and relative contents of aroma components in rose water

图8 玫瑰花水(a)和玫瑰细胞液(b)的总离子流图Fig.8 Total ion current chromatograms of rose water (a) and rose cell fluid (b)

玫瑰花水和玫瑰细胞液中共鉴定出60种香气组分，其中玫瑰花水鉴定出59种香气成分，相对含量较高的有香茅醇、甲基丁香酚、丁香酚、α-松油醇、芳樟醇等；玫瑰细胞液鉴定出22种香气成分，相对含量较高的有香茅醇、苯甲醇、甲基丁香酚、α-松油醇、(E)-氧化芳樟醇、芳樟醇等。

续表1

续表1

由表1可以看出，2种玫瑰花露的香气成分在种类和含量上均存在差异，共有成分包括香茅醇、橙花醇、苯甲醇、苯乙醇、甲基丁香酚等21种，在玫瑰花水和玫瑰细胞液中相对含量之和分别为76.60%、78.42%；玫瑰花水特有成分有乙醇、2-乙烯基-2,6,6-三甲基四氢-2H-吡喃、2-庚酮等38种，相对总含量为15.26%；玫瑰细胞液特有成分只有苯甲醛，相对含量为0.60%。

玫瑰花水和玫瑰细胞液中醇类化合物相对含量较高，共鉴定出26种，醇类化合物是玫瑰的主体香气成分，其含量决定了玫瑰花露的品质。玫瑰花水特有7种酮类和7种酯类物质，相对含量之和分别为2.21%和2.45%；玫瑰细胞液特有1种醛类物质，相对含量为0.6%。玫瑰花露中醚类物质差异显著，共鉴定出7种，玫瑰花水中醚类物质含量明显高于玫瑰细胞液，其中玫瑰花水特有成分有苄甲醚、橙花醚、愈创木酚。此外，萜烯类化合物也是玫瑰花露香气的重要组成成分，是玫瑰头香的必要组成部分，共鉴定出5种，其中(E)-B-罗勒烯、萜品油烯、δ-榄香烯是玫瑰花水特有成分。除了上述物质外，还鉴定出7种其他类化合物，在玫瑰花水和玫瑰细胞液中的相对含量分别为4.93%和1.47%，其中2-乙酰基呋喃、2-乙烯基-2,6,6-三甲基四氢-2H-吡喃、3,7-二甲基-1,3,7-辛三烯是玫瑰花水特有成分，现有文献对这类物质的来源鲜有报道，故需进一步研究确定。

2.3 质谱解析方法对玫瑰花露香气组分鉴定的影响

2.3.1自动质谱退卷积定性系统的应用 重叠峰是常见的解析难点，用单一谱库难以定性。AMDIS基于模型峰的逻辑和算法，把峰形模式完全相同的碎片峰提取出来重新组合，构建相对纯净的质谱图，可实现对化合物的准确定性[14]。AMDIS处理图谱后，对重叠峰进行拆分提取，可提高其解析能力，对化合物进行更加准确地定性分析。保留时间为25.199 9 min的峰示于图9，在AMDIS未提取前用NIST14谱库检索时，按匹配度排序第一的是庚酸甲酯(正/反匹配度为793/773)，排序第二的是萜品油烯(正/反匹配度为729/746)，匹配度均较低，无法鉴别；经AMDIS对TIC图进行拆分提取处理，该峰为内嵌峰，自动拆为2个峰后分别用NIST14谱库自动检索，将保留时间25.199 9 min的峰鉴定为庚酸甲酯(匹配度为94.6)，保留时间25.161 7 min的峰鉴定为萜品油烯(匹配度为91.5)。保留时间22.670 0 min的峰示于图10，用NIST14谱库检索时，排序第一的是2,2-二甲基-5-(1-甲基-1-丙烯基)四氢呋喃(正/反匹配度为850/817)，排序第四的是1-戊醇(正/反匹配度为756/783)，按谱库匹配度定性，该峰鉴定结果应为2,2-二甲基-5-(1-甲基-1-丙烯基)四氢呋喃；TIC图经AMDIS处理，该峰拆为2个峰，检索结果为保留时间22.669 5 min的峰是2,2-二甲基-5-(1-甲基-1-丙烯基)四氢呋喃(匹配度为92.2)，保留时间22.727 7 min的峰是1-戊醇(匹配度为91.0)。保留时间40.990 0 min的峰示于图11，在NIST14谱库检索时，排序前四的均是芳樟醇(正/反匹配度为932/934)，结合文献[15]报道，芳樟醇是玫瑰花露的香气成分，该峰往往会定性为芳樟醇，但经AMDIS提取，该峰是内嵌峰，保留时间40.990 3 min的峰是芳樟醇(匹配度为98.3)，保留时间41.007 5 min的峰是苯甲醛(匹配度为93.7)，其中苯甲醛具有抗菌作用[16]。该方法为玫瑰花露产品功效开发提供了新思路。

图9 保留时间25.199 9 min的峰Fig.9 Peak of retention time 25.199 9 min

图10 保留时间22.670 0 min的峰Fig.10 Peak of retention time 22.670 0 min

图11 保留时间40.990 0 min的峰Fig.11 Peak of retention time 40.990 0 min

利用NIST谱库对微量化合物进行检索时会出现匹配度较低的情况，无法鉴定未知物。如保留时间为55.960 1 min的峰，在玫瑰花水和玫瑰细胞液中的相对含量分别为0.57%、0.30%，含量均较低。其TIC图未经AMDIS提取时，化合物匹配度最高为723/708，且未检索出橙花醇(CAS：106-25-2)；经AMDIS提取后，保留时间55.960 1 min的峰可鉴定为橙花醇(匹配度95.8)。另外，用NIST14谱库检索保留时间46.711 5、48.088 0 min的峰时，也出现匹配度较低的情况，TIC图经AMDIS提取后，保留时间46.711 5 min的峰鉴定为苯甲酸甲酯(匹配度为92.1)，在玫瑰花水中的相对含量为0.12%；保留时间48.088 0 min的峰鉴定为乙酸香茅酯(匹配度为96.0)，在玫瑰花水中的相对含量为0.42%。

2.3.2保留指数的应用 为了提高定性的准确性，结合保留指数进一步鉴别化合物。保留指数表示物质在固定液上的保留值行为，具有重现性好、温度系数小及标准统一等优点，是国际上常用的定性方法，该方法广泛应用于食品、香精香料、中药、烟草等分析中[17-20]。保留指数计算公式为：RI=100n+100[t-tn]/[t(n+1)-tn]，式中，RI为保留指数；n和n+1 分别为目标物出峰前后正构烷烃的碳原子数；tn和tn+1分别为相应正构烷烃的保留时间；t为未知物在谱图中的保留时间(tn

在定性过程中，易出现多个高匹配度的化合物或匹配度较低的现象，此时仅通过谱库检索的方法难以准确定性目标化合物。如保留时间为 31.100 2 min的峰，经NIST14 质谱库检索，匹配出3-己烯醇(正反匹配度为860/883)和叶醇(正反匹配度为858/879)，仅根据匹配度很难确定未知化合物。通过对比保留指数进行验证，可知3-己烯醇和叶醇的保留指数文献值分别为1 391和1 382，计算保留时间31.100 2 min的未知化合物保留指数为1 391.99，将文献引用值与计算值比对，很容易确定该化合物为3-己烯醇。保留指数法可提高香气成分鉴定的准确性，在玫瑰花露香气成分的定性分析中具有应用前景。

3 结论

本研究通过单因素试验，优化了顶空固相微萃取法提取玫瑰花露香气成分的条件。采用气相色谱-质谱联用法检测萃取的玫瑰花露香气成分，并利用AMDIS和保留指数对其组分进行定性分析，从玫瑰花水和玫瑰细胞液中共鉴定出60种香气组分，其中玫瑰花水59种，玫瑰细胞液22种，玫瑰花水和玫瑰细胞液共有成分21种，相对含量之和分别为76.60%、78.42%；玫瑰花水38种特有成分，相对含量之和为15.26%；玫瑰细胞液1种特有成分，相对含量为0.60%。结果表明，该定性方法克服了常规谱库检索的不确定性，几种方法相互验证、相互支撑，进一步提高了定性结果的准确性和可靠性，该定性思路也可用于其他复杂样品挥发性成分的检测。