禽用疫苗总蛋白质和内毒素含量初检对生产的指导评价

康翠翠，张妹，陈小娇，陈文平

（北京市华都峪口禽业有限责任公司、国家蛋鸡产业技术体系平谷综合试验站，北京平谷 101206）

目前，养禽业是我国主流畜牧养殖业之一，然而，随着禽类各种疾病的暴发，对鸡群的健康产生巨大的影响。 为了确保鸡群健康，除做好生物安全外， 疫苗也是保护鸡群健康必不可少的一员。 蛋白质和内毒素含量是评价疫苗的两种指标。 疫苗中的蛋白质含量过高会促使机体产生一些生物活性物质，进而引发机体产生反应。而疫苗中的内毒素会作用于单核巨噬细胞和多形核白细胞，进而产生一些活性因子，导致机体产生应激反应[1]。 然而对于禽类疫苗，目前尚未有关于蛋白质和内毒素含量的明确规定。 本文对市场上的几种禽类疫苗进行蛋白质和内毒素检测， 拟了解目前禽类疫苗蛋白质和内毒素含量情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

CBA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购买自碧云天生物技术公司，鲎试剂（灵敏度0.25 EU/毫升）和细菌内毒素工作标准品（10 EU/支）均购自湛江安度斯生物有限公司， 细菌内毒素检查用水购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司。 各种禽用疫苗由各公司提供。 疫苗具体信息如表1。

表1 试验所用疫苗名称及厂家

1.2 试验方法

1.2.1 总蛋白质测定

1.2.1.1 前期处理

参考《中华人民共和国农业部公告第2078号》测定疫苗蛋白质含量。 将疫苗从冰箱中取出使其恢复至常温，上下颠倒使其混合均匀，从中取出100 微升置于1.5 毫升离心管中，加入900微升丙酮， 充分混匀后于室温放置10 分钟，15000 克4℃离心15 分钟，去除上清液。 向沉淀中加入400 微升丙酮，震荡后短暂离心，去除上清液。 再次用400 微升丙酮洗涤沉淀，震荡后短暂离心去除上清液，将离心管盖打开，室温晾干直至沉淀物为粉末状。 每管添加100 微升去离子水，置于超声波中超声20 分钟，使其充分溶解。 每种疫苗重复3 次。

1.2.1.2 蛋白质含量检测

蛋白质检测流程严格按照CBA 蛋白浓度测定试剂盒进行。

1.2.2 内毒素检测

1.2.2.1 疫苗前期处理

参考宋海岩等[2]的冻融方法， 取12 毫升混合均匀后的疫苗于15 毫升离心管中，置于-20℃冰箱冷冻48 小时， 取出后使其于室温中融化，完全融化后再次置于-20℃冰箱冷冻24 小时， 取出后置于室温中融化，3500 克离心15 分钟，弃去上层乳状物，吸取下层水相于5 毫升离心管中。

1.2.2.2 内毒素限度试验

参考2015 年版《中国药典》 中细菌内毒素含量检测方法。取内毒素标准品一只，加入1 毫升检查用水，旋涡混匀5 分钟。后期利用检查用水分别制备浓度为4λ 和2λ 的内毒素标准品液。 利用检查用水进行供试品稀释，和4λ 内毒素标准品液共同配制浓度为2λ 的供试品溶液。

取鲎试剂42 只，其中2 只为阴性对照管，2只为阳性对照管， 其余每4 只用于一种疫苗的检测，2 只为供试品检查管，2 只为供试品阳性对照管。 每只鲎试剂中加入0.1 毫升检查用水，其中阴性对照管再次加入0.1 毫升检查用水，阳性对照管加入0.1 毫升浓度为2λ 的内毒素标准品溶液，供试品检查管加入0.1 毫升稀释后的供试品，供试品阳性对照管中加入浓度为2λ 的供试品溶液。 封闭鲎试剂管口，轻轻摇匀，将鲎试剂管垂直放入37℃恒温箱中孵育60 分钟，取出观察，在取出过程中避免振动。 将试管缓慢倒转180°，若管底形成凝胶且凝胶不变形不从管壁脱落为阳性，若管底未形成凝胶、凝胶变形或从管壁脱落均为阴性。 阴性对照管需为阴性，阳性对照管和供试品阳性管需为阳性， 整个试验结果才有效。

2 结果

2.1 蛋白质标准曲线

严格按照CBA 试剂盒制作标准曲线。 如下图1 所示，表中线性相关系数R2=0.9995，显著相关。

图1 按照CBA 试剂盒制作的曲线

2.2 疫苗蛋白质结果

从表2 可知，按照生产厂家进行分析，发现不同厂家的疫苗蛋白质含量不同。 综合而言，除铝胶苗外，B 厂家疫苗蛋白质含量最高， 其次是厂家D， 两家蛋白含量均在1000 微克/毫升以上； 厂家C 和F 蛋白含量在500～1000 微克/毫升内；厂家A 和E 蛋白质含量在500 微克/毫升以下。

表2 各厂家各疫苗蛋白质含量

按照单苗与联苗进行分析， 发现单苗和联苗间蛋白质含量并无明显关系。

按照油苗和铝胶苗进行分析， 发现B 厂家中油苗中蛋白质含量高于铝胶苗。

2.3 鲎试剂灵敏度复核试验

取细菌内毒素工作标准品一只用细菌内毒素检查用水溶解，旋涡混合后进行稀释，制成浓度为0.50、0.25、0.125 和0.06 EU/毫升的内毒素标准品。 取鲎试剂安剖瓶18 支，分别为阴性对照2 支，各浓度内毒素标准品4 支。 将鲎试剂用0.1 毫升检查用水溶解后，分别加入各浓度内毒素标准品0.1 毫升，阴性对照管加入0.1 毫升检查用水。 轻轻混匀后封闭管口，垂直放入37℃恒温箱中60 分钟，观察结果。

从表3 可知， 鲎试剂复核结果中细菌内毒素浓度为0.50 EU/毫升时为阳性，内毒素浓度为0.06 EU/毫升时凝胶结果为阴性，说明试验结果有效。 本次灵敏度复核试验显示本试验所用鲎试剂灵敏度为0.25 EU/毫升，与其标识灵敏度一致。

表3 鲎试剂灵敏度复核试验结果

2.4 内毒素凝胶限度试验

按照中国药典方法对各疫苗进行内毒素检测。 如表4 可知，8 种疫苗中有3 种疫苗内毒素含量大于50EU/毫升，其余5 种疫苗含量均小于50 EU/毫升。

表4 各厂家各疫苗内毒素含量

3 讨论

本文参考农业农村部规定的检测口蹄疫灭活苗蛋白质含量方法对各种疫苗进行总蛋白质含量检测，参考中国药典2015 版细菌内毒素含量检测方法检测各疫苗内毒素含量。 结果显示不同疫苗其蛋白质含量和内毒素含量差异明显，尤其是蛋白质含量差异较大。 疫苗中杂蛋白质含量过高可能会引起鸡群局部发热， 停食甚至死亡。

目前对于禽类疫苗中蛋白质含量未有明显的规定。 农业农村部规定的口蹄疫疫苗中蛋白质含量为小于500 微克/毫升， 疫苗内毒素含量为小于50 EU/毫升。 本研究中疫苗蛋白质含量最低为B 厂家的传染性鼻炎 （A 型） 灭活疫苗（铝胶苗）182 微克/毫升， 最高为B 厂家的禽脑脊髓炎灭活疫苗， 蛋白含量可达3822 微克/毫升，远超500 微克/毫升。两种疫苗蛋白含量差距可达20 倍。 说明疫苗蛋白质含量与生产厂家无必要联系，可能与疫苗制备工艺有关。 本文检测的8 种疫苗中其中5 种疫苗蛋白含量超过500微克/毫升， 说明目前禽用疫苗中蛋白质含量较高。

疫苗中内毒素含量是目前各方最为关注的问题， 疫苗内毒素含量过高会影响机体健康[2]。本研究检测的8 个疫苗中有3 个疫苗内毒素含量超过50 EU/毫升， 说明大部分疫苗内毒素含量低于50 EU/毫升。 此外内毒素含量大于50 EU/毫升的疫苗分别属于3 个厂家，说明内毒素含量的高低与厂家并无直接关系， 与各疫苗的制作工艺有关。

本文通过对市场上禽类疫苗进行蛋白质和内毒素含量检测， 初步了解禽类疫苗中蛋白质和内毒素的含量范围， 为后期疫苗中蛋白质和内毒素的检测提供了方法， 同时为疫苗的质量评估提供了数据支撑。