柴术理胃饮对肝郁脾虚型功能性消化不良大鼠p38MAPK、NF-κB 表达的影响

范明明，韩海瑞，林 伟，张嘉裕，王 顺

（1.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150036；2.黑龙江省中医药大学，哈尔滨 150040）

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）作为消化系统多发的、常见的疾病，严重影响患者生活质量。亚洲国家每100 人就有5～30 人患有功能性消化不良，在发达国家高达10～40 人[1]。罗马Ⅳ诊断标准[2]在综合症状与进餐关系的基础上将餐后不适综合征（PDS）和上腹痛综合征（EPS）纳为功能性消化不良的2 个亚型。功能性消化不良主要表现为上腹部胀痛、早饱感、嗳气、食欲不振、呕吐等症状的临床综合征[3-4]。导师根据多年临证经验，自拟柴术理胃饮治疗肝郁脾虚型功能性消化不良。为了探讨其作用机制，我们研究了该方对功能性消化不良大鼠胃肠运动功能及下丘脑组织中磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）、核转录因子（nuclear factor NF）-κB p65 蛋白和基因表达的影响。

1 实验材料

选用60 只黑龙江中医药大学实验动物中心的SPF级健康SD 大鼠，6 周龄，雄性，体质量（220±20）g，许可证号：SCXK 黑2016004。为保障动物饲养福利，给予健康、充足饮食、饮水，提供清洁、舒适的生活环境，全过程将严格遵循《实验动物管理与使用指南》中有关规定执行，方案获得黑龙江省中医药科学院伦理委员会批准。moticam3000 显微摄影系统，美国motic；双垂直蛋白电泳仪（DYCZ-24DN）、凝胶成像系统（WD-9413B），北京六一公司；超速冷冻离心机（H-2050R），湖南湘仪公司；电热恒温培养箱（DH36001B），天津泰斯特公司；酶标仪（ELX-800），BIOTEK 公司；荧光定量PCR 仪（ABI7500），Applied Biosystems 公司。柴术理胃饮（柴胡15 g，白术15 g，党参20 g，枳实10 g，白芍15 g，陈皮10 g，姜半夏10 g，丹参10 g，砂仁10 g，炙甘草10 g）：常规水煎浓缩为10.8 g/mL 后4 ℃冰箱保存备用；用蒸馏水将10 mg/片的多潘立酮（西安杨森公司）制成0.3 mg/mL 的药液。

2 实验方法

2.1 动物分组 将大鼠随机分为6 组，每组10 只，分组遵循随机数字表法原则：模型组、柴术理胃饮低、中、高剂量组和多潘立酮组。其中多潘立酮组为阳性对照组，另设空白组10 只。

2.2 造模方法 采用复合因素方法制备肝郁脾虚型FD 大鼠模型：慢性疲劳、悬尾刺激和饮食失节[5-7]。

2.3 药物治疗 造模后通过旷场试验对大鼠进行综合评价，合格者视为模型制备成功。按照《药理实验方法学》根据体质量换算给药剂量，每天给药1 次，持续21 d。空白组、模型组大鼠给药剂量按公式计算为10 mL/（kg·d），选用生理盐水灌胃[8]，柴术理胃饮组分别给予不同浓度水煎剂灌胃，给药剂量分别为：13.5、27 和54 g/kg；阳性对照组按3.125 mg/kg 给予多潘立酮水溶液灌胃。

2.4 胃肠动力测定 实验前，大鼠全部不禁水，同时12 h 内禁食，用1 mL/100 g 的碳素墨水给其灌胃。30 min后麻醉，选用1%戊巴比妥钠，剂量为40 mg/kg，严格按照规范实验步骤操作，注射部位为大鼠腹腔。先用真空采血管心脏取血，分离血清备用。再分别检测胃排空率和小肠推进率[9]。胃排空率（%）＝（全胃重－空胃重）/全胃重×100%。小肠推进率（%）＝碳墨在小肠推进的距离/小肠总长度×100%。

2.5 p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表达 WB 法检测大鼠下丘脑组织中p-P38MAPK、NF-κB p65蛋白表达。

2.6 p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表达 RT-PCR 检测下丘脑组织中p-P38MAPK、NF-B p65 mRNA 表达。引物序列均在北京Invitrogen 公司合成。引物序列如下：β-actin，Forward：5’-CATCTCTTGGAAGTCCA-3’，Reverse：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，280 bp；p-P38，Forward：5’-CTGGAGGAGTTCAATGACGTG-3’，Reverse：5’-CGGAGGATTTGGTAGATAAGGA-3’，122 bp；NF-κB p 65，Forward：5’-TCTGCCG AGTAAACCGGAAC-3’，Reverse：5’-CAGGCTAGG GTCAGCGTATG-3’，200 bp。

2.7 大鼠下丘脑组织病理形态学观察 为研究柴术理胃饮给药前后大鼠下丘脑组织的变化，在胃肠动力检测完成后，将下丘脑组织制成厚度为4 μm 的切片，通过HE 染色观察其病理学变化。

2.8 统计学方法 实验数据采用均数±标准差（）表示，应用SPSS 20.0 软件包进行统计分析。采用单因素方差分析，组间比较t检验。

3 实验结果

3.1 大鼠一般状态 在造模开始时，各组大鼠的饮水量、食量、体质量、粪便和皮毛的色泽等都正常，大鼠神态安静且活泼好动，皮毛干净整齐，两睛有神。造模后，动物的饮水量逐渐减少且进食量也相应减少，身体轮廓日渐瘦削，粪便质稀，眼神无光，皮毛无华且茂密度较前稀，活动度也不如造模前，对周围环境变化的应对能力也大为下降。各治疗组大鼠经过21 d的柴术理胃饮治疗，进食量、饮水基本恢复到造模前水平，粪便、精神、体质量和皮毛色泽等方面均恢复至正常水平，但模型组除外。

3.2 各组大鼠进食量和体质量的变化 见表1。

表1 各组大鼠造模后和治疗后进食量和体质量的变化（，n =10）g

表1 各组大鼠造模后和治疗后进食量和体质量的变化（，n =10）g

注：与正常组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.3 各组大鼠胃肠动力比较 见表2。

表2 各组大鼠胃肠动力比较（，n =10） %

表2 各组大鼠胃肠动力比较（，n =10） %

注：与正常组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.4 各组大鼠下丘脑组织p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表达 与空白组相比，模型组大鼠下丘脑组织中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表达率明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，柴术理胃饮各剂量组和多潘立酮组大鼠下丘脑组织中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表达率明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图1、表3。

图1 Western blot 法检测各组下丘脑组织p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白表达

表3 各组下丘脑组织p-p38MAPK、NF-κB p65 蛋白表达（，n =3）

表3 各组下丘脑组织p-p38MAPK、NF-κB p65 蛋白表达（，n =3）

注：与正常组比较，## P ＜0.01，与模型组比较，△△P ＜0.01

3.5 各组大鼠下丘脑组织p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表达 与空白组比较，模型组大鼠下丘脑组织p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 的表达水平上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，柴术理胃饮各剂量组及多潘立酮组大鼠下丘脑组织p-P38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表达水平下调，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表4。

表4 各组下丘脑组织p-P38MAPK、NF-B p65 mRNA 表达（，n =3）

表4 各组下丘脑组织p-P38MAPK、NF-B p65 mRNA 表达（，n =3）

注：与正常组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.6 各组大鼠胃组织病理学表现 各组大鼠胃窦组织黏膜层和肌层规整，层次结构完整，相关病理变化不可见；大鼠细胞在各组织层里规则的排列，空白组无炎性细胞浸润，柴术理胃饮各剂量组和模型组胃窦黏膜层均可见淋巴细胞及中性粒细胞浸润，但柴术理胃饮组较模型组轻，肌层未见明显异常。见图2。

图2 柴术理胃饮对各组大鼠胃组织的影响（×100）

4 讨论

功能性消化不良在临床上相当常见，该病是一种功能性胃肠病，在《功能性消化不良中医诊疗专家共识意见（2017）》中，此病属于中医“胃痛”“胃痞”范畴[10]。随着祖国医药的不断进步，越来越多的患者寻求中医药治疗。《临证指南医案·卷六·郁》云：“悒郁动肝致病，久则延及脾胃中伤，不纳，不知味。”故此证多因情志伤肝木，致使肝失于调达而横逆犯脾；《素问·痹论》[11]云：“饮食自倍，肠胃乃伤。”故平素饮食失节、过于劳倦，致使脾气受损而失于健运，脾湿渐生郁于肝木，肝木失于疏泄遂成此证[12]。其本在脾胃受损而虚，其标在肝气不达而郁滞，宜标本兼治，培元固本。基本治法多采用益气健脾、解郁疏肝[13]，中药方选柴术理胃饮加减。

柴术理胃饮主治肝郁脾虚证，有疏肝解郁，健脾益气之功效。整方组成为柴胡、白术、党参、枳实、白芍、陈皮、姜半夏、丹参、砂仁、炙甘草。据《神农本草经》[14]载：“柴胡，味苦平。主心腹，去肠胃中结气，饮食积聚……轻身明目益精。”味辛、苦，性微寒，归肝胆肺经，能疏肝解郁，使肝气调达，《滇南本草》[15]云：“行肝经逆结之气，止左胁肝气疼痛”，白术性温，味甘、苦，归脾胃经，擅补气健脾，可助脾运化，以资气血生化之源，二者共为君药。党参味甘，性平，归脾、肺经，擅补中益气，健脾益肺，养血生津，与白术相伍[16]，既可健补脾胃之气，亦能助运化，主治脾胃气虚之症；枳实、陈皮理气行滞而和胃，陈皮以升为主，上提郁滞诸气，枳实以降为要，下沉上滞之气，升降相因相用，以疏肝理脾；白芍与柴胡相伍[17]，既得芍之养血柔肝、敛阴止汗，兼具缓急止痛功效，白芍得柴胡，养阴气机不滞，故而又不失利肝之用，养肝之体，俱为臣药。半夏、砂仁和胃燥湿，益气和胃，行气化滞；丹参味苦微寒，归心肝经，活血祛瘀、通经止痛；甘草调和药性，与白芍相合，增缓急止痛之功，俱为佐使药。

胃肠道运动功能障碍是功能性消化不良较为重要的发病机制之一，主要包括餐后胃运动障碍，胃排空延迟，餐后食物分布异常，胃肌电异常等[18]。p38MAPK信号通路是MAPK家族的重要组成部分[19]，激活后转移至细胞核。体外和体内研究表明，100 多种蛋白质易受 p38 MAPK 的直接磷酸化，其中约一半是转录因子，其余的底物包括蛋白激酶、磷酸酶、凋亡调节因子、生长因子受体和细胞骨架蛋白等。这些底物及其下游靶点介导p38 信号在炎症、细胞周期调节、增殖、存活和死亡等多种细胞过程中的功能[20]。NF-κB是一种转录因子，可调节免疫应答、炎症反应等。在胃肠系统中，一方面NF-κB 活性与胃溃疡、克罗恩病等疾病的发病有关，另一方面NF-κB 可以促进受损肠上皮再生，防止辐射诱导的肠上皮坏死和肠损伤[21]。课题组在实验中发现，功能性消化不良大鼠的下丘脑组织中的p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表达量发生异常改变，故而从该角度探讨其与功能性消化不良发生发展的相关性。

本实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠下丘脑组织中的p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表达量增多；柴术理胃饮不同剂量组能不同程度地降低大鼠下丘脑组织中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表达量，其药理作用呈量效关系。

本研究结果表明，柴术理胃饮可以改善肝郁脾虚型功能性消化不良大鼠的胃排空功能、促进小肠推进功能、降低大鼠下丘脑组织中p-P38MAPK、NF-κB p65 蛋白和基因表达量等作用，这可能是其治疗功能性消化不良的作用机制之一。