白芍花提取工艺及功能性饮料的研究

徐睿，李美景，刘荣，冉红燕，龙玉婷，熊丽娟，谢凯莉，龚慕辛*

（1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069）

白芍花是毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥花蕾，为中药白芍的非药用部位，是种植中药的副产物，具有很高的观赏价值[1]和药食两用价值[2]。但在药用芍药栽培过程中，其花常常被当作废弃物，造成资源浪费[3]。白芍花常用来治疗因内分泌紊乱引起的雀斑、黄褐斑、暗疮，可延缓皮肤衰老，促进新陈代谢，提高机体免疫力[4]。研究显示上述作用与其所含有的花色苷、黄酮、单萜苷和酚酸类成分有关[5-8]。前期研究测定了不同栽培品种及干燥工艺白芍花的体外抗氧化、抑制酪氨酸酶、胰脂肪酶活性以及其中芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸等9种活性成分含量[9]，发现栽培品种“亳州芍药”烘干品的综合活性以及活性成分含量最高，同时建立了各活性与9种成分的相关关系，确定了对上述活性有益的正向成分和不利的负向成分及对各活性的影响系数。目前以同属毛茛科、芍药属的牡丹花为原料的食品研究类型很多[10]，但对于白芍花尤其是饮料类型的产品研发较少，本研究拟在此基础上开发一种白芍花提取物饮料，拓展白芍花的用途。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白芍花：采集于白芍主产区安徽亳州，经首都医科大学中医药学院李佳副教授鉴定为毛茛科植物芍药的干燥花蕾，在60℃下热风烘干。

对照品芍药苷[（paeoniflorin，PF）批号L26A0003，纯度≥95%]、没食子酸[（gallic acid，GA）批号BD09A036，纯度≥98%]、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷[（quercetin-7-O-β-D-glucoside，Qu7G） 批号 BC08A031，纯度≥98%]、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷[（quercetin-3-O-β-D-glucoside，Qu3G）批号 BA25B061，纯度≥98%]、紫云英苷[（kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside，Km3G）批号BF27A070，纯度≥98%]、芍药内酯苷[（albiflorin，AF）批号 CI17B213，纯度≥95%]、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷[（isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside，Is3G）批号BF27A033，纯度≥95%]：成都普思生物科技股份有限公司；山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷[（kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside，Km7G）批号 D01S9S69103，纯度≥98%]：上海源叶生物科技有限公司；芍药素-3，5-O-β-二葡萄糖苷[（peonidin-3，5-O-β-diglucopyranoside，Pn3G5G）批号 0509/0-02，纯度≥95%]：法国EXTRASYNTHESE公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：美国Fisher公司；甲酸、95%乙醇（均为分析纯）：北京化工厂；液相用水为纯净水。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪（ultra performance liquid chromatography，UPLC）（1260 infinity Ⅱ型）：美国安捷伦公司；微波萃取装置（P70D20TL-D4型）：佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；1/10万电子天平（DV215CD型）：美国奥豪斯公司；1/100电子天平（TP-402型）：丹佛仪器（北京）有限公司；超声波清洗器（KQ-500E型）：江苏昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪（J1811252型）：北京西冲科技发展有限公司；电热恒温水浴锅（HHS-11-6型）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

称取亳州芍药干燥花蕾20 g，粉碎（过100目筛），按照单因素试验和正交试验的不同方案进行提取，两层滤纸抽滤，在60℃水浴下减压浓缩至无醇味，以70%乙醇定容至100 mL，超声混匀10 min，精密量取5 mL溶液至蒸发皿中，在85℃水浴上挥干，加适量甲醇溶解残渣并定容至25 mL，过0.22 μm微孔滤膜，得质量浓度为0.04 g/mL的白芍花甲醇溶液。

1.3.2 9种活性成分含量的测定

参考前期试验方法，并进行一定调整[9]。精密称取9种对照品，用甲醇溶解得到对照品母液。分别取适量对照品母液混合，加甲醇定容得到的初始浓度分别为 0.525 0、0.198 0、0.500 0、0.645 0、0.179 0、0.100 0、0.288 0、0.125 0、0.110 0 mg/mL 的 GA、Pn3G5G、AF、PF、Qu7G、Qu3G、Km3G、Is3G、Km7G 混合对照品溶液，依次稀释得到不同浓度的其它混合对照品溶液。将上述混合对照品溶液依次进样，在275、525、230、350 nm 4种波长下测定其峰面积，以各成分色谱峰面积为纵坐标，以对照品中各成分的质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。将供试品溶液按相同方法操作，通过已鉴定出的9种成分所对应的峰面积，计算样品中相应的含量。

1.3.3 提取物活性综合评分的计算

根据前期对白芍花9种有效成分的化学成分及其活性进行相关分析，得到各成分体外抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性、抑制胰脂肪酶活性标准化系数K，其中对活性有正向作用的成分K值为正，负向作用的成分K值为负。随后对各活性成分含量进行归一化处理，以各成分含量的归一化值di与标准化系数Kij（i为各成分，j为各活性指标）乘积之和作为多成分转换成的某一活性值，即活性j（j分别为抑制酪氨酸酶、抑制胰脂肪酶、抗氧化活性），其中抗氧化的活性j取抗氧化1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法、铁离子还原法以及二铵盐法三者活性j的均值，而每个样品3个活性j之和即为该样品的活性综合评分，计算公式为：活性j=∑Kidi。

1.3.4 工艺流程

亳州芍药干燥花蕾→适度破碎→70%乙醇浸泡→微波辅助提取→过滤→浓缩→添加辅料→装瓶→冷却→灭菌→检验→成品

1.3.5 工艺要点

1.3.5.1 提取方式的选择

根据1.3.2方法测定3种提取方法测得9种活性成分含量，并按照1.3.3方法计算不同提取方式所得白芍花提取液的综合评分。1）加热回流法：准确称量粉碎后亳州芍药干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次1 h。2）温浸法：准确称量粉碎后亳州芍药干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇在60℃水浴下浸提2次，每次1 h。3）微波辅助提取法：准确称量粉碎后亳州芍药干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇常温浸泡30 min，微波功率为480 W，提取时间为4 min（分4次，每次1 min，冷却至45℃再提取），提取2次。提取物用两层滤纸抽滤，合并滤液，旋转蒸发至少量溶液后，用70%乙醇定容至100 mL，即得样品溶液。

1.3.5.2 单因素试验

根据提取工艺试验结果，固定提取方式为采用微波辅助提取，以综合评分为指标进行单因素试验。固定料液比为 1∶15（g/mL），先常温浸泡 30 min，微波功率为480 W，提取时间为4 min，提取2次，考察乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%）对样品综合评分的影响。

固定乙醇体积分数为70%，先常温浸泡30 min，微波功率为480 W，提取时间为4 min，提取2次，考察料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]对样品综合评分的影响。

固定乙醇体积分数为70%，料液比为1∶15（g/mL），先常温浸泡30 min，提取时间为4 min，提取2次，考察功率（160、320、480、560 W）对样品综合评分的影响。

固定乙醇体积分数为70%，料液比为1∶15（g/mL），先常温浸泡30min，微波功率为480W，提取时间为4min，考察提取次数（1、2、3、4次）对样品综合评分的影响。

固定乙醇体积分数为70%，料液比为1∶15（g/mL），先常温浸泡30 min，微波功率为480 W，提取2次，考察提取时间（1、2、3、4 min）对样品综合评分的影响。

1.3.5.3 提取工艺正交试验

根据单因素试验结果，固定提取次数为3次，确定以提取时间（A）、微波功率（B）、料液比（C）、乙醇体积分数（D）为试验因素进行正交试验，因素水平见表1。

表1 提取工艺正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for extraction process

1.3.6 白芍花提取物饮料配方优化正交试验

根据前期单因素试验考察结果，初步确定加水稀释倍数为 5倍，以阿斯巴甜（a）、柠檬酸（b）、乙基麦芽酚（c）添加量为试验因素进行正交试验，每个因素3个水平，因素水平设计见表2。

表2 配方优化正交试验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for formula optimization

邀请10名同学和老师为感官评价小组，以感官评分为指标，对不同辅料添加量的9组白芍花饮料进行感官评价。其中，产品感官评价标准分别从甜味、香味、涩味、酸味、外观5个方面进行评分。提取物饮料调配感官评价标准见表3。

表3 提取物饮料的感官评价标准Table 3 Sensory evaluation standards for extract beverage

1.4 数据处理

使用Excel 2016进行数据统计分析和图形的绘制。

2 结果与分析

2.1 提取方式的选择

提取方式对亳州芍药干燥花蕾提取物综合评分的影响见图1。

图1 提取方式对综合评分的影响Fig.1 The effect of extraction method on the comprehensive score

由图1可知，以加热回流法提取方式综合评分最高，温浸法得分最低。但加热回流法提取时间长，杂质溶出率高，静置后沉淀多。而微波辅助提取利用被加热物质的极性分子在电磁场中快速转向及定向排列产生热量，以达到提取效果[11]，其选择性高、加热迅速、灭菌能力强、安全无污染[12-13]，参照文献[14-16]进行比较，并结合生产中的实际要求，最终确定采用微波辅助提取方式对白芍花进行提取。

十九大报告中明确提出“培养造就一支懂农业、爱农村、爱农民的‘三农’工作队伍”［1］。基层农技人员队伍是“三农”工作队伍的重要组成部分，他们长期扎根基层、切实服务“三农”，是培育造就有文化、懂技术、会经营的新型职业农民，发展现代农业、实施乡村振兴战略的重要力量。台州科技职业学院作为浙江省九大现代农业技术培训基地之一，承担浙江省基层农技人员知识更新培训任务。基于往年培训中发现有基层农技人员在培训课间流露对自身职业存在倦怠感的情况，而开始关注我省基层农技人员的职业状态，并着手开展调研，探究其真实职业现状、挖掘倦怠原因、有针对性地提出相关建议。

2.2 提取工艺单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数的确定

乙醇体积分数对亳州芍药干燥花蕾提取物综合评分的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对综合评分的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the comprehensive score

由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，综合评分逐渐升高，当体积分数达到70%时综合评分达到最高值。可见在40%～70%范围内，体积分数与综合评分呈正相关。根据相似相溶原理，较高的乙醇体积分数有利于脂溶性的酚酸类、单萜类、黄酮类物质溶解，从而增加了综合评分。同时考虑到过高的乙醇体积分数在进行微波辅助提取时会带来安全隐患，所以未进行更高体积分数的试验，因此选择50%～70%进行正交试验。

2.2.2 料液比的确定

料液比对亳州芍药干燥花蕾提取物综合评分的影响见图3。

图3 料液比对综合评分的影响Fig.3 The effect of solid-to-liquid ratio on the comprehensive score

由图 3 可知，料液比为 1∶15（g/mL）时综合评分高于其它3组。原因可能是随着溶剂体积增加，传质推动力增大，活性成分的提取量会不断增多[17]；料液比从1∶15（g/mL）增加至 1∶25（g/mL）时，综合评分略有下降。因此正交试验选择 1∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）进行优化。

2.2.3 微波功率的确定

微波功率对亳州芍药干燥花蕾提取物综合评分的影响见图4。

图4 微波功率对综合评分的影响Fig.4 The effect of microwave power on the comprehensive score

由图4可知，综合评分随着微波功率的增大先升高后降低，功率为480 W时评分最高，但320、560 W与480 W评分差距不明显。其原因是随着微波功率增大产生的热效应更强，但更高的功率也会增加影响综合评分的负向成分的提取率，也会破坏部分活性成分的结构[18]。因此正交试验选择320 W～560 W进行优化。

提取次数对亳州芍药干燥花蕾提取物综合评分的影响见图5。

由图5可知，综合评分随着提取次数的增加而升高，且提取次数达到3次后，再增加提取次数对综合评分影响较小，从生产工艺角度来说，更多的提取次数会增加生产成本以及时间，因此确定提取次数为3次。

图5 提取次数对综合评分的影响Fig.5 The effect of extraction times on the comprehensive score

2.2.5 提取时间的确定

提取时间对亳州芍药干燥花蕾提取物综合评分的影响见图6。

图6 提取时间对综合评分的影响Fig.6 The effect of extraction time on the comprehensive score

由图6可知，综合评分随着提取时间的增加先升高，在3 min时达到最大值，随后呈现下降趋势，原因可能是微波辅助提取时间过长产生的高温会使以槲皮素为苷元的黄酮苷发生降解[19]，同时PF含有的苯甲酸酯键在有水的条件下受热易分解或受其他成分的干扰[20]。因此正交试验选择2 min～4 min进行优化。

2.3 提取工艺正交试验

在单因素试验结果的基础上，以综合评分为考核指标，按照L9（34）正交表进行试验，每组试验重复两次，取其平均值，对亳州芍药干燥花的提取工艺条件参数进行优化，其试验结果见表4、表5。

表4 提取工艺优化正交试验Table 4 Orthogonal test design for optimization of extraction process

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4可知，亳州芍药干燥花蕾提取中影响综合评分主次顺序为提取时间＞乙醇体积分数＞微波功率＞料液比；由正交试验得出最优因素水平组合为A1B2C2D2，即提取时间 2min、微波功率 480W、料液比 1∶20（g/mL）、乙醇体积分数60%、提取3次。由方差分析结果可知，提取时间、微波功率、料液比、乙醇体积分数均对亳州芍药干燥花蕾综合评分影响显著。

2.4 验证试验

按最优组合条件A1B2C2D2即正交试验2号组，提取3次，测定其9种活性成分含量，并计算其综合评分，结果分别为3.000 0、2.838 9、2.888 0，平均值为2.909 0，接近正交试验最好值2.990，且相对标准偏差为2.84%，说明优化工艺稳定可行。

2.5 配方优化试验

以感官评分为指标进行正交试验，依据表2的感官评价标准对白芍花提取物饮料进行评分，其试验结果见表6。

表6 配方优化正交试验Table 6 Orthogonal test design for formula optimization

由表6可知，白芍花提取物饮料配方优化中影响感官评分主次顺序为阿斯巴甜＞柠檬酸＞乙基麦芽酚；由正交试验得出最优因素水平组合为a3b2c3，即阿斯巴甜含量0.032%、柠檬酸含量0.4%、乙基麦芽酚含量0.06%与正交优化结果一致。

3 结论

本研究通过单因素试验和正交试验，得出白芍提取物饮料的工艺参数和最适辅料添加量。采用微波辅助提取技术，最佳提取条件为微波功率480 W、乙醇体积分数 60%、料液比 1∶20（g/mL），提取时间 2 min，提取3次；将提取物溶液稀释5倍，加入0.032%阿斯巴甜、0.4%柠檬酸、0.06%乙基麦芽酚，所制成的白芍花提取物饮料感官评分为78.0分，风味独特，达到了预期的效果。