提取樱桃中植物病毒RNA方法的建立与优化

刘杰,于成明,陈芳龙,郭静静,IDA BAGUS ANDIKA,曹欣然*

提取樱桃中植物病毒RNA方法的建立与优化

刘杰1,于成明2,陈芳龙1,郭静静1,IDA BAGUS ANDIKA1,曹欣然1*

1. 青岛农业大学植物医学学院,山东 青岛 266109 2. 山东农业大学植物保护学院,山东 泰安 271018

RNA提取是现代分子生物学中的一项常用技术，是后续试验的基础。樱桃样品中富含大量的糖类和酚类物质，同时富含降解RNA酶，为提取高质量的RNA带来了极大的困难。为探寻能够提取樱桃中高质量RNA以满足Northern Blot等分子实验的要求，对近年来国内外常用的RNA提取方法进行了筛选和归纳，进行优化并同商品化试剂盒进行了比较和评价分析。结果表明：尽管适用于樱桃RNA提取的方法有很多，但其在提取樱桃总RNA的效果各有不同，试剂盒B提取的RNA质量好，改良SDS法可以提取出纯度高且量大的樱桃总RNA，改良CTAB法次之。

樱桃; 植物病毒; 提取RNA

提取核酸和蛋白质是分子生物学中最基础但也是最关键的方法。它是后续实验和产品开发(包括诊断试剂盒)的起点[1]。提取高质量的RNA对于Northern杂交实验至关重要[2-4]，分离出的核酸质量和完整性将直接影响所有后续实验的结果[5]。常见的分离提取试剂有SDS和CTAB两种；同时在富集核酸时也可以使用Oligo(dT)富集柱[6]和功能化磁珠[7]等方法。高质量的核酸应不含污染物，常见的污染物包括蛋白质、碳水化合物、脂质或酚类等[1]，可通过添加还原剂、螯合剂、氧化抑制剂等方法去除酚类化合物，可通过盐酸胍、低浓度乙醇、高浓度NaCl等去除多糖，可通过加入蛋白质变性剂去除蛋白质[4]。

樱桃(Sweet Cherry)为蔷薇科樱属落叶果树，樱桃叶片与根茎组织内多糖、多酚及色素等次生代谢物质含量很高，提取RNA时受这些成分的干扰严重[8]。同时樱桃组织中核糖核酸酶含量较高，提取过程中RNA易降解；组织中含水量高，导致核酸浓度低等问题[9]。常规提取方法不能有效去除樱桃中富含的多糖多酚等杂质，不能有效抑制RNA酶的分解，导致提取的RNA不能适用于Northern杂交等后续实验[9]。因此，本试验通过改良传统的SDS与CTAB法，使其适用于樱桃叶片的高质量RNA提取，用于后续实验，可为提取其他植物组织材料中也富含多糖多酚类的RNA提供参考指导。

1 材料与方法

1.1 材料

樱桃叶片采集自青岛农业大学城阳校区附近果园

1.2 试剂

RNA Extraction Buffer:0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8）、0.01 mol/L EDTA、0.5 % SDS、0.05 mol/L NaCl；CTAB:2 % (w/v)CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl (pH=8)、0.02 mol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl；8 mol/L LiCl；3 mol/L NaAC （pH=5.2）；5 mol/L KAC （pH=5.8）；无水乙醇；5 mol/L NaCl；DEPC 处理过的 ddH2O；异丙醇；酚仿（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）；氯仿异戊醇（氯仿:异戊醇=24:1）；PVP；PVPP；β-巯基乙醇；以上所有试剂均为分析纯。试剂A：AG RNAex Pro Reagent购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；试剂B：TAKARA RNAiso plus购自宝日医生物技术(北京)有限公司；试剂C：TAKARA RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue购自宝日医生物技术(北京)有限公司；试剂盒A：TRANS TransZol Plant购自北京全式金生物技术有限公司；试剂盒B：TIANGEN RNA Easy Fast Plant Tissue Kit购自天根生化科技（北京）有限公司；试剂盒C：AG SteadyPure Qiuck RNA Extraction Kit购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 RNA提取方法

传统SDS法：传统SDS法沿用同实验室Andika等[10]的方法。传统CTAB法：传统CTAB提取方法参考河北农业大学张恺恺等[11]的方法。商品化RNA提取试剂方法参照各自说明书。

1.4 实验设计

将RNA提取过程分为研磨提取过程、抽提杂质过程、沉淀过程、三个部分。根据这三个过程，设计单因素变量进行RNA提取方法优化。

1.4.1提取过程优化使用RNA Extraction Buffer作为提取液，又分别加入（1）1 %体积的β-巯基乙醇[12]；（2）0.2 g PVP[13]；（3）0.02 g PVPP[12]；（4）1 %体积的β-巯基乙醇和0.2 g PVP[12,14,15]；（5）1 %体积的β-巯基乙醇和0.02 g PVPP[9]；（6）0.2 g PVP和0.02 g PVPP；（7）1 %体积的β-巯基乙醇、0.2 g PVP和0.02 g PVPP[16]七组以及对照组，其余步骤相同。使用CTAB作为提取液，也同样添加以上7组试剂以及对照组，其余步骤相同。

1.4.2 抽提过程优化使用RNA Extraction Buffer作为提取液，在抽提时分别采用以下方式进行：（1）氯仿抽提1次；（2）氯仿异戊醇（24:1）抽提1次；（3）酚仿（25:24:1）抽提1次；（4）酚仿抽提1次，氯仿抽提1次；（5）酚仿抽提1次，氯仿异戊醇抽提1次；（6）酚仿抽提两次；（7）酚仿抽提1次，取上清加入1/2体积NaCl和1/2体积氯仿异戊醇抽提1次[17,18]；（8）酚仿抽提1次，取上清加入1/3体积KAC混匀冰浴30 min，加入等体积氯仿异戊醇抽提1次；（9）酚仿抽提1次，取上清加入1/10体积KAC和1/5体积无水乙醇冰浴30 min，加入等体积氯仿异戊醇抽提1次。使用CTAB作为提取液，也同样添加以上9组试剂，其余步骤相同。

1.4.3 沉淀过程优化沉淀过程分别对沉淀试剂和沉淀方法进行优化；沉淀试剂分别使用异丙醇-NaAC和LiCl，其余步骤相同；沉淀方式分别采用离心管沉淀和富集柱沉淀，其余步骤相同。

2 结果与分析

2.1 提取过程

使用RNA Extraction Buffer时，添加β-巯基乙醇、PVP和PVPP的处理提取效果最好，添加PVPP和β-巯基乙醇效果次之；使用RNA Extraction Buffer所有处理中，添加β-巯基乙醇效果明显优于未添加的处理。当使用CTAB时，添加PVP和PVPP的处理提取效果最好，添加β-巯基乙醇、PVP和PVPP的处理次之，在使用CTAB的所有处理中含有PVPP的处理均优于未添加PVPP的处理。在相同处理条件下，使用CTAB作为提取缓冲液的RNA浓度高于使用RNA Extraction Buffer。

2.2 抽提过程

当使用RNA Extraction Buffer 时，进行两次酚仿抽提的处理效果最好，进行一次酚仿抽提，一次氯仿异戊醇抽提的处理次之；对于所有处理，两次抽提效果明显优于一次抽提效果，但两次抽提会损耗部分RNA。使用CTAB处理结果与RNA Extraction Buffer结果一致。经过此次优化后，抽提两次后，使用CTAB的处理RNA损耗高于使用RNA Extraction Buffer的处理。

2.3 沉淀过程

使用RNA Extraction Buffer处理中，使用LiCl作为沉淀试剂的效果明显优于使用异丙醇-NaAC。当使用CTAB处理中，使用LiCl作为沉淀试剂的效果略低于使用异丙醇-NaAC。

使用富集柱法的处理中，其RNA质量与对照组无明显差异，但使用富集柱法的处理中，离心时间缩短，沉淀溶解时间缩减，可大幅缩短沉淀时间。

2.4 最终优化方案

改良SDS法提取过程中使用RNA Extraction Buffer同时添加β-巯基乙醇、PVP和PVPP；抽提过程使用两次酚仿抽提；沉淀过程使用LiCl作为沉淀试剂。改良CTAB法提取过程中使用CTAB同时添加PVP和PVPP；抽提过程使用两次酚仿抽提；沉淀过程使用异丙醇作为沉淀试剂。结果显示，改良SDS法与改良CTAB法均优于传统SDS法和传统CTAB法，且在所有组别中改良SDS法最优，改良CTAB法次之。在商品化试剂中，试剂盒B最优。

图1 RNA质量比较

注：使用1 %TAE琼脂糖凝胶，点入等量的样品进行电泳。依据胶图样品顺序，在研磨样本量均为0.2 g的条件下，使用微量分光光度计测量浓度，结合加水量计算RNA提取总量，RNA提取量=RNA浓度×加水量。

Note: We used 1% TAE agarose gel and added equal volume samples. According to the order of the samples on the gel picture, under the condition that the sampling quantities were 0.2 g, we measured the concentration with a micro spectrophotometer, and calculated the total RNA extracted quantity considered with the amount of water added. RNA extraction quantity = RNA concentration × Amount of water added.

3 讨论

提取高质量的RNA是Northern Blot的核心关键步骤。植物组织中存在的蛋白质、多糖多酚以及其他次生代谢物质严重影响了RNA的提取，尤其是甜樱桃叶片组织中富含多糖多酚。在植物细胞空间内，这些物质是与核酸分离的，但当植物细胞被研磨破碎后，这些物质就会与RNA产生相互作用[19]。酚类化合物被氧化后会与RNA结合，该过程不可逆，并会导致RNA的活性丧失；多糖会与RNA共沉淀形成难溶的胶状物；无论内源还是外源的RNase均会造成RNA的降解；同时细胞中的次级代谢产物极易与RNA结合，从而阻碍RNA的分离。因此能否有效地去除甜樱桃叶片中多糖、酚类化合物、RNase和其它代谢产物是能否提取到高质量RNA的关键[19-22]。

本实验中使用传统SDS法的样品浓度最高，但条带降解较重；改良SDS法的样品浓度与传统SDS法差别不大，并且条带完整，非常适合后续核酸分子杂交试验；试剂盒B虽然条带完整性较好，但其浓度较低；传统SDS法与传统CTAB法浓度相对较高，RNA条带降解严重，均不能满足Northern Blot要求。其他试剂虽然浓度相对较高，但是条带几乎不可见，推测是RNA降解导致，但可以满足RT-PCR及常规分子生物学实验要求。吸附柱的沉淀方法对于RNA质量并无明显提升，但是可以有效减少RNA沉淀过程的耗时。

本研究优化出改良SDS法，可提取出樱桃样品中高质量的RNA，RNA完整性较好，浓度高，可满足后续Northern杂交。改良SDS法比天根试剂盒性价比高，但总提取时间较长，可根据实验室具体情况进行选择。尤其在进行大批量Northern杂交实验时，更适宜选择改良SDS法。若RT-PCR等常规分子生物学实验时，也可以选择传统方法和商品化试剂。若进行快速检测时，商品化试剂盒更为适合。总而言之，该RNA提取方法的建立为樱桃样品的分子生物学研究提供了的技术基础，同时也为其他富含多糖多酚的植物材料的RNA提取有提供了借鉴。

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Establishment and Optimization of the Method Extracting the Virus RNA from Sweet Cherry

LIU Jie1, YU Cheng-ming2, CHEN Fang-long1, GUO Jing-jing1, IDA BAGUS ANDIKA1, CAO Xin-ran1*

1.266109,2.271018,

RNA extraction is a common technology in modern molecular biology and the basis of subsequent experiments. Sweet cherry samples are rich in carbohydrate and phenolic compound, as well as RNase, which brings great difficulties to extract high-quality RNA. In order to explore the extraction of high-quality RNA from cherry for the requirements of Northern blot and other molecular experiments. During recent years the commonly used domestic and international RNA extraction methods were screened and summarized. We also optimized the RNA extraction methods, and the RNA extraction methods were compared with the commercial RNA extraction kit. The results showed that although there are many methods for extracting plant virus RNA from sweet cherry, the effects of extracting total RNA were different. The quality of RNA extracted by kit B is good. The improved SDS method can extract total RNA with the highest purity and quantity. The improved CTAB method is less effective than the improved SDS method.

Sweet cherry; plant virus; RNA extraction

[Q939.46]

A

1000-2324(2021)06-0922-04

2021-06-08

2021-07-25

国家自然科学基金(32001867,31970159);山东省自然科学基金(ZR2020QC129)

刘杰(1994-),男,硕士研究生,研究方向:分子植物病毒学. E-mail:904328951@qq.com

通讯作者:Author for correspondence. E-mail:xinran1001@163.com