妊娠期糖尿病新型候选生物标志物的筛选研究

2022-01-23黄萍萍缪海燕于红虹吴冬梅赖玉婷江心泳王冠东

护理研究 2022年1期

黄萍萍，葛莉*，缪海燕，于红虹，吴冬梅，赖玉婷，江心泳，王冠东，陈凡

1.福建中医药大学护理学院,福建 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期最常见的代谢紊乱。2019 年数据显示，全球约有15.8%的孕妇存在不同程度的高血糖，其中GDM 占83.6%[1]。持续增长的GDM 患病率对世界公共卫生问题构成了严重的威胁，不仅对孕产妇与子代的近远期健康具有潜在的影响[2-4]，还给医疗保健系统带来了巨大的经济负担[5]。由于GDM 筛查诊断主要在妊娠中晚期，使得早期防护缺乏针对性，一旦确诊则干预治疗的时间有限[6]，且目前尚未筛选出公认具有临床价值的生物标志物。因此，获知GDM 的发病机制，寻求灵敏度高、特异性强的生物标志物用于早期筛查已经成为产科领域研究的一个重点。已知GDM 是胎盘起源的疾病，本课题组前期通过同位素标记的相对与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)的定量蛋白组学结合平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)技术筛选与验证出外血小板溶素1(epiplakin，EPPK1)、冷诱导RNA 结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRBP)、不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，HNRNPA2B1)、不均一核糖核蛋白AB(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B，HNRNPAB)、不均一核糖核蛋白L(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，HNRNPL)、RAS 癌基因家族成员RAB21(ras-related protein Rab-21，RAB21)、RAS癌基因家族成员RAB3B(ras-related protein Rab-3b，RAB3B)7 个蛋白在GDM 组胎盘组织中表达显著上调。由于胎盘蛋白与GDM 的发生发展紧密联系[7-8]，妊娠期间母体外周血循环中存在与胎盘相关和(或)胎盘组织释放入血的蛋白[9]，且关于胎盘蛋白的GDM 早期筛查指标的研究处于起步阶段。因此，本研究通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测这7 个胎盘蛋白是否在孕妇外周血清中有表达且是否与在胎盘中的表达趋势一致，从而筛选出候选生物标志物，为后续临床纵向队列验证和生物标志物开发提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2019 年7 月—2019 年10 月在福建中医药大学附属第二人民医院产科门诊常规产检及住院分娩的GDM 孕妇30 例为病例组(GDM 组)，同期选取年龄、孕周等指标与GDM 组相匹配的正常糖耐量孕妇30 例为对照组。本研究通过福建中医药大学附属第二人民医院伦理委员会批准（批件号：2018-KL024-02），并且所有的研究对象均签署纸质版知情同意书。纳入标准：①符合GDM 诊断标准[10]的妊娠37～42 周的孕妇；②无其他妊娠合并症；③经产妇既往无GDM 病史。排除标准：①孕前有高血压、先天性心脏病及肝肾功能不全病史；②合并多囊卵巢综合征及垂体、肾上腺及甲状腺等功能异常的内分泌疾病；③多胎妊娠、早产、胎儿畸形、胎儿宫内生长受限或死胎；④使用皮质激素类药物或近1 周使用影响糖脂代谢的药物；⑤产前发热或近期有炎症、感染及创伤等其他应激状态；⑥产检及分娩资料不完整的孕产妇或既往有烟酒不良嗜好的孕产妇。

1.2 资料收集

1.2.1 一般指标记录两组研究对象24～28 周口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）血糖值、糖化血红蛋白(HbA1c)值、年龄、孕次、产次、分娩方式等指标，由专人测量研究对象产前体重、身高，计算产前体质指数(body mass index，BMI)。

1.2.2 外周血标本所有孕妇均于孕37～42 周入院待产期间抽取清晨空腹肘静脉血2 mL 置促凝管中，血标本于1 h 内在4 ℃下3 000 r/min 离心10 min，将1 mL 血清分装为4 管后置于—80 ℃冰箱保存待测。

1.2.3 ELISA 检测筛选候选生物标志物根据试剂盒说明书稀释标准品；设置空白孔(不加样品和酶标试剂)、标准孔和样品孔，标准孔内加入不同浓度的标准品50 μL，样品孔先后加入样本稀释液40 μL 和样品10 μL；用封板膜封板后于37 ℃孵育30 min；弃掉液体拍干并加满洗涤液，静置30 s 后弃去、拍干，重复5 次；除空白孔外，其他加入酶标试剂50 μL 后37 ℃孵育30 min；再次洗涤5 次后，每孔加入显色剂A、显色剂B各50 μL，37 ℃避光显色10 min；每孔加入终止液50 μL，在15 min 内用450 nm 波长测量各孔的吸光度值。

1.3 统计学方法用SPSS 22.0 软件进行统计分析，Graph Pad Prism 8 作绘图分析。定量资料符合正态分布时用均数±标准差（±s）表示，进行两独立样本t检验；不符合正态分布时先进行对数转换，若仍然呈非正态分布则进行非参数检验，数据用中位数(M)、四分位数间距(IQR)表示。对非等级定性资料进行χ2检验。对筛选出的候选生物标志物指标进行二元Logistic 回归分析，选择对GDM 发生有显著影响的蛋白指标，用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析其对诊断GDM 的敏感性、特异性和截断值。P＜0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象临床资料比较 GDM 组孕妇在孕24～28 周进行75 g OGTT 检测血糖的0 h、1 h、2 h血糖值和HbA1c 均显著高于对照组，年龄、产前BMI、孕次、产次、分娩方式、居住地、文化程度及职业等临床资料差异无统计学意义（P＞0.05），两组具有可比性。见表1。

表1 两组研究对象临床资料比较

2.2 两组孕妇外周血清EPPK1、CIRBP、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPL、RAB21、RAB3B 表达水平比较由于在检测过程中GDM 组有1 例样本的每个指标均出现极大值，本研究经核对孕妇基本资料与病史并未发现有特殊之处，故将该样本数据予以剔除后进行分析。ELISA 结果显示GDM 组EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而其余3个蛋白HNRNPA2B1、HNRNPL、RAB21 在GDM 组和对照组血清中的表达量差异均无统计学意义（P＞0.05），结果详见图1和表2。

表2 两组孕妇血清EPPK1、CIRBP、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPL、RAB21、RAB3B 表达水平比较[M(IQR)]单位：pg/mL

图1 两组EPPK1、CIRBP、HNRNPAB、RAB3B、HNRNPA2B1、HNRNPL、RAB21 表达比较的箱式图(A 为EPPK1；B 为CIRBP；C 为HNRNPAB；D 为RAB3B；E 为HNRNPA2B1；F 为HNRNPL；G 为RAB21)

2.3 GDM 发生影响因素的二元Logistic 回归分析以是否GDM 为因变量，EPPK1、CIRBP、RAB3B和HNRNPAB 表达水平为协变量进行二元Logistic 回归分析，结果显示EPPK1 和RAB3B 高表达是GDM发生的影响因素。见表3。

表3 GDM 发生影响因素的二元Logistic 回归分析

2.4 EPPK1 和RAB3B 对GDM 的检验效能分析为评价EPPK1和RAB3B在GDM诊断中的价值，以EPPK1绘制ROC 曲线，结果显示，截断值为550.0 pg/mL，曲线下面积(AUC)为0.885，灵敏度为0.931，特异度为0.733，具有统计学意义；以RAB3B 绘制ROC 曲线，则截断值为333.1 pg/mL，AUC 为0.779，灵敏度为0.966，特异度为0.633，具有统计学意义。见图2。

图2 EPPK1 和RAB3B 检验GDM 效能的ROC 曲线(A 为EPPK1;B 为RAB3B)

3 讨论

GDM 是全球范围内日益严重的公共卫生问题，它增加了妊娠期高血压、羊水过多、产后出血、巨大儿、产伤、新生儿低血糖的发生率和母儿远期患2 型糖尿病、代谢综合征及心血管疾病的风险[2-4]。研究表明，及时发现和治疗GDM 能够有效改善妊娠结局[11]。生物标志物在临床上可以用来预测或诊断疾病，洞察疾病的病理生理过程，并可用于对治疗干预的药理学反应的监测或临床结局的预测[12]。因而，关于GDM 的早期筛查生物标志物的开发受到了广泛关注。

目前，临床上对于GDM 的诊断和治疗过程的效果判断均以监测血糖为主，但现有研究发现即使严格治疗使血糖达到目标水平，GDM 病人胎盘的形态与功能依然会发生改变[13-14]，其母婴并发症的发生率仍高于正常孕妇[15]。故仅依靠血糖监测不足以很好地达到预测和防治GDM 及其并发症的目的。迄今为止，已报道的GDM 早期预测因子包括一些血糖标志物[16-18]、炎症标志物[16]、胰岛素抵抗标志物[19]、脂肪细胞衍生标志物[20]和胎盘衍生标志物[21-22]等，但这些指标存在诸多不足之处，如有的研究结果不一致、有的特异性或敏感性较差、有的没有临床可用的阈值、有的预测能力较低等，且大多数为小样本病例对照研究，也没有进行成本效益分析[23]。因此，目前临床上尚缺乏方便、简单、经济、特异性和敏感性高的早期筛查指标。

本研究ELISA 结果显示，GDM 组血清EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 表达水平均高于对照组，与前期胎盘组织iTRAQ 和PRM 蛋白组学的研究结果一致，说明这4 个蛋白在GDM 中的表达呈现稳定上调的趋势，可能对GDM 的发生发展过程具有重要作用。Logistic 回归分析发现，EPPK1 和RAB3B 高表达是GDM 发生的影响因素；进一步分别以EPPK1 和RAB3B 指标绘制ROC 曲线，当EPPK1 截断值为550.0 pg/mL 时，其对GDM 检验效能的灵敏度为0.931，特异度为0.733，AUC 为0.885；当RAB3B 截断值为333.1 pg/mL 时，RAB3B 对GDM 检验效能的灵敏度为0.966，特异度为0.633，AUC 为0.779。提示临床上应该对血清EPPK1＞550.0 pg/mL 和RAB3B＞333.1 pg/mL 的孕妇实行严格的妊娠期血糖监测，以及时发现血糖异常并进行干预。因此，前期iTRAQ、PRM 和本研究ELISA 多重组合检测结果一致，结合ROC 曲线分析结果，本研究认为EPPK1 和RAB3B 可以作为GDM 的候选生物标志物。

因为理想的生物标志物应在生物体中稳定表达、检测的样本容易获得、对疾病状态的相关变化敏感，能够在临床症状出现之前对疾病进行早期检测，具有区分疾病病理的能力，并具有成本效益和重复性[24-25]。故本研究的重要意义主要在于筛选出了GDM 潜在的生物标志物，为新型生物标志物的开发提供了方向与思路。至于EPPK1 和RAB3B 能否成为具有临床可用性的标志物，还需要对不同人群进行大样本的前瞻性队列研究。由于本研究是病例对照设计研究，仅收集妊娠晚期孕妇的血清进行蛋白表达水平检测，未能明确和比较这些蛋白指标在发展为GDM 和未发展为GDM 的孕妇整个孕期的动态表达变化过程。因此，未来研究可采用纵向队列研究，检测与对比EPPK1、CIRBP、 HNRNPA2B1、 HNRNPAB、 HNRNPL、RAB21 和RAB3B 在GDM 和正常孕妇妊娠早、中、晚期血清中的表达情况，并进行ROC 曲线分析了解其对GDM 的预测能力及价值。相信随着今后对相关实验研究日益展开和临床大样本研究的验证，能够揭示这些蛋白在GDM 发病中的因果关系和具体作用途径与机制，并有望成为该病的新型生物标志物，在GDM 的早期筛查、预防及早期的治疗干预中具有重要价值。