海南黑山羊IGF2基因SNPs检测与生长性状的关联性分析①

管凇 周汉林 荣光 徐铁山 孙卫平 胡海超

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南 海口 571101）

海南黑山羊的养殖历史悠久，可以追溯到1 700多年前，又称东山羊。海南黑山羊具有许多优良特性，具有耐湿热、耐粗饲、抗病力强，肉质鲜嫩多汁，皮薄肉厚，脂肪分布均匀，胶原蛋白丰富，膻味小，羊胎素含量高，胆固醇含量低等特点。但是海南黑山羊生长缓慢，个体小，繁殖力低，严重影响生产效益和市场需求，一直以来，海南黑山羊个体矮小的分子机制不明确。因此，通过候选基因法，筛选影响海南黑山羊生长性状的分子标记，如果能应用于育种实践中，对于海南黑山羊的提纯复壮、品种选育以及杂交利用都有着重要意义。通过生物信息学工具分析和预测基因突变对性状影响的分子机理在现代生命科学领域发挥出越来越重要的作用。

胰岛素样生长因子2基因（Insulin like Growth Factor‐2，IGF2）是一种多功能细胞增殖调控因子，对细胞的分化、增殖、胚胎的生长发育作用，刺激培养细胞生长，研究表明，胰岛素样生长因子对于骨骼肌的生长发育和肌肉细胞的成熟分化有着精密的调控的功能，在动物生长发育过程中起重要作用。许多研究结果发现，IGF2基因影响猪初生重、断奶重、平均日增重、生长速度、背膘厚、瘦肉率等重要经济性状［1‐2］，可作为用于育种实践的分子遗传标记［3］。李丰田等［4］利用分子生物学技术克隆了辽宁绒山羊IGF2基因，并对IGF2的信号肽和蛋白质亲水性进行检测分析。结果表明，IGF2仅含有一个TATA－box，3个CpG岛，且IGF2有信号肽序列，属于分泌蛋白。本文以海南黑山羊为研究对象，选取IGF2基因为候选基因，采用直接测序和SnaPshot分型方法检测海南黑山羊IGF2基因是否存在单核苷酸多态性，以及对生长性状进行关联性分析，探讨海南黑山羊生长迟缓、个体矮小的原因，为探究海南黑山羊生长发育分子机制以研究提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 样品采集和生长性状的测定

样品采自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所山羊海南黑山羊保种场的耳组织样。测量的生长性状包括体长、体高、体重，一共测量了104只成年山羊，同时，对测定的山采集耳组织，采样前对每头仔猪耳朵用75%乙醇消毒，剪取耳组织，置于装有75%乙醇的离心管中，低温环境下带回实验室备用。DNA提取采用试剂盒提取耳组织总DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，并用紫外分光光度计检验每个样品DNA质量浓度，每35个DNA构建1个总DNA池。

1.2 引物设计

从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）数据库中获得山羊IGF2基因DNA序列（GenBank登录号分别为NC_030836），根据SNP位点序列信息，使用引物设计软件PrimerPlex2设计PCR反应引物，使用primer3plus在线设计单碱基延伸引物，引物序列为上游3’CGGGAAAC‐GTCGTTCAAATC5’，下 游3’TCGTGCGTG‐GTTTTGACTTG5’，扩增片段为265 bp。

1.3 SNP位点的筛选和分型

对提取的DNA基因组序列进行扩增，PCR扩增反应总体积为10μL：5μL（5×）TaqPCR mas‐termix，上下游引物各0.5μL（20μmol/L），模板DNA1μL（20 ng/uL），加ddH2O至10μL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；45个循环（94℃，20 s；60℃，30 s；72℃，30 min）；72℃再延伸3 min。在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP（shrim palk aline phosphatase，虾碱性磷酸酶）处理，以去除体系中游离的dNTPs。在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积5μL。委托武汉天一辉远生物科技有限公司对PCR产物进行进一步分型，采用SnaPshot方法分型，并统计出每个样品的SNP位点的基因型。

2 数据分析和结果

对IGF2基因第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子进行SNP多态性位点筛选，结果只在第一外显子115bp处检测到一个SNP多态性位点，突变位点G→A转换（见图1），属于同义突变，没有导致氨基酸改变。突变位点有效等位基因数（Ne）为1.166，观测杂合度（Ho）为0.135，期望杂合度（He）0.142，平均多态信息含量（PIC）为0.132；多态位点有3种基因型GG、GA、AA，GG基因型89个，GA基因型14个，AA基因型1个，基因型与体长，体高，体重之间的关联性分析差异不显著（见表1）。

表1 多态位点与基因之间的关联性

图1 突变位点的序列比对结果

3 讨论

IGF2基因是家畜重要经济性状的候选基因，根据目前的国内外研究结果，已发现显著影响目标性状的分子标记。薛慧良等［5］研究发现，IGF2基因外显子8存在对猪初生重和6月龄背膘厚有显著影响的分子标记位点。刘桂兰等［6］发现，IGF2基因内含子8存在不同基因型，不同基因型对猪的肥肉率、瘦肉率、背膘厚有存在显著相关性。Van‐Laere等［7］利用EMSA、荧光素酶报告基因和基于亚硫酸盐甲基化分析等方法，证实猪IGF2基因内含子3中存在一个影响肌肉发育的功能性单核苷酸多态性。韩瑞华等［8］发现IGF2基因有与秦川牛宰前活重、胴体重、胴体长、胴体胸深、眼肌面积显著相关的分子标记位点，同时，与大理石花纹、嫩度、pH24也存在显著相关性。IGF2基因存在与与生长性能、屠体重和腹脂率等重要经济性状显著相关的分子标记位点［9‐10］。颜炳学等［11］研究发现，IGF2基因外显子2中的存在对鸡胸角宽、腺胃重、半净膛重有显著性影响的分子标记。李玉冬等［12］采用生物信息学对鸡IGF2基因进行功能性分析好预测，发现T30P和E35G位点突变严重影响鸡IGF2蛋白质的结构，可能是影响鸡生长和体组成性状的重要功能性SNPs。陈则东等［13］在鸡的IGF2基因外显子1中检测到与4周龄体质量呈显著正相关的基因型。黄永震等［14］研究发现，IGF2基因存在4个单核苷酸多态性位点及其单倍型，与秦川牛体高、体长、胸宽、胸深和体重存在显著相关性，与18～24月龄郏县红牛的体重存在显著相关性［15］，说明IGF2基因对牛生长性状具有显著影响。毛海霞等［16］研究结果表明，IGF2基因第二外显子的单核苷酸多态性位点与郏县红牛的胸围、体重存在显著相关性，可以用于郏县红牛遗传育种选育的分子标记，张争锋等［17］研究发现，IGF2基因第二外显子的单核苷酸多态性位点与南阳牛6、12、18、24月龄体斜长和胸围，12、18、24月龄的坐骨端宽，初生、6月、24月龄体重等显著相关，是南阳牛选育非常有价值的分子标记辅助选择位点。

赵拴平等［18］研究发现IGF2基因第一内含子的3个SNP多态性与大别山牛群体部分生长性状具有显著或极显著的相关性。武建亮等［19］提示IGF2可作为脂肪沉积的候选基因应用于标记辅助选择。多态信息含量（PIC）和杂合度（He）是度量群体内遗传变异的标记，数值越高，说明遗传变异越大，选择潜力越大。本研究只在IGF2基因第一外显子115 bp处检测到一个SNP多态性位点，突变位点G→A转换，属于同义突变，没有导致氨基酸改变。突变位点有效等位基因数（Ne）为1.166，观测杂合度（Ho）为0.135，期望杂合度（He）0.142，平均多态信息含量（PIC）为0.132。多态信息含量和杂合度较低，属于低度多态，说明群体遗传变异小，选择潜力不大。多态位点有三种基因型GG、GA、AA，GG基因型89个，GA基因型14个，AA基因型1个，基因型与与体长，体高，体重的关联性分析显示差异不显著，可能检测的群体样本少，长期圈养和近交繁殖导致群体纯合度高，个体之间性状差异不显著。