油菜素内酯对盐胁迫下黄芩幼苗生理生化特性的影响

华智锐，李小玲

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)为唇形科黄芩属的多年生草本植物，根部入药，有调节血脂、抗病毒、抗菌、消炎、除热安胎、凉血、止血等功效，是常用大宗中药材之一[1]。近年来，黄芩在黄酮类提取物和中药生产等方面具有很高的应用价值，其在药材市场需求量巨大。由于野生黄芩资源的人工采集过于严重，市场上黄芩生产的主要来源仍然依赖于人工引种、驯化、田间栽培，土壤盐渍化的加剧对黄芩的生产构成了很大的危害[2]。

当今世界，土地盐渍化和水资源短缺严重影响了农作物的发展和生态环境的改善。在我国大部分黄芩产区，黄芩的生长过程均会遇到程度不同的盐胁迫伤害，干湿变化造成盐分在土壤中逐渐积累。水分是重要的生态环境因子，短期的盐胁迫条件在一定程度上能改变药用植物中必要代谢过程产物的积累与合成[3]。盐胁迫会使植物的生理生化特性发生明显改变，打破植物中活性氧的正常产生，导致细胞内积累过多的活性氧，从而影响植物的正常生长发育过程，比如细胞膜系统受到损坏、丙二醛(MDA)含量升高、抗氧化能力、渗透调节能力下降等。为了缓解和消除植物受到的氧化胁迫，植物细胞内出现了包括由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等组成的抗氧化酶防御系统。植物体抵抗盐等胁迫的机制之一就是增加脯氨酸含量，其作为一种渗透调节物质，可以防止水分外流，使作物体内的水势下降，同时起到对细胞内大分子结构的保护作用。利用添加外源物对植物进行处理，是目前一种普遍用于提高植物抗逆性的简便方式。

油菜素内酯(BR)是一种甾体类化合物，又称芸苔素或芸苔素内酯，具有调控植物的根茎伸长、种子萌发、叶片伸展等功能，其生理生化活性已明显超过现有的乙烯、生长素和细胞分裂素等5大激素，被国际上誉为第6大激素[4]，它被认为是一种高活性的植物生长调节物质。它属于甾醇类植物激素，在植物对非生物或生物胁迫的反应中发挥着重要的作用。它在极低浓度下对植物表现出强烈的生理和生化作用。有研究表明，BR可以提高作物在各种不利因素生长下的抗性，比如干旱[5]、低温[6]、盐害[7]、低氧[8]等，可有力地促使盐胁迫下植物种子的萌发和幼苗生长，提高植物叶片光合能力，增强抗氧化酶的活性，降低质膜通透性和膜脂过氧化产物MDA含量[9]，且BR的不同处理方式和不同处理浓度对盐胁迫下植物的处理结果不尽相同[10-11]。BR在农林业生产中被广泛应用于促进植物生长、改善植物的生理代谢及提高植物抗逆性等[12]。在盐胁迫条件下，施用外源BR可以增加可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质的含量，从而保持植物细胞膨压，起到降低和缓解植株在盐胁迫条件下遭受的迫害程度。

迄今为止，有关对黄芩生产和栽培的研究主要集中在生理生化方面[13-15]，但通过添加BR缓解黄芩盐胁迫伤害的研究未见报道。本研究通过查阅文献，参考前人研究基础，以盆栽商洛一年生黄芩幼苗作为试验材料，开展通过添加适宜外源物浓度增强黄芩抗盐性和降低盐胁迫对黄芩的胁迫研究，探究不同浓度的油菜素内酯对盐胁迫条件下商洛黄芩幼苗生理生化指标的影响，以期为地方黄芩的合理栽培和抗逆性生理方面的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采自商洛商山中药材种植基地的商洛一年生黄芩幼苗。

1.2 试验方法

1.2.1 黄芩的盆栽育苗 先将4月中旬采回的一年生黄芩幼苗移栽到20 cm直径的花盆中，育苗培养15 d，再选取长势均匀一致的黄芩幼苗进行试验处理。

1.2.2 黄芩的盐胁迫处理 配置0.5% NaCl溶液[2]；先取无水乙醇少量溶解油菜素内酯，再加适量蒸馏水稀释配制成浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L的油菜素内酯处理溶液；设置蒸馏水为CK1,以添加0.5% NaCl处理为CK2。每天10:00时，采用叶面喷施的方法对黄芩幼苗叶片进行处理，正反两面叶片按要求均匀喷施。

本试验设置7个处理。处理1(CK1)：蒸馏水；处理2(CK2)：蒸馏水+0.5% NaCl；处理3(T3)：0.1 mg/L BR+0.5% NaCl；处理4(T4)：0.2 mg/L BR+0.5% NaCl；处理5(T5)：0.3 mg/L BR+0.5% NaCl；处理6(T6)：0.4 mg/L BR+0.5% NaCl；处理7(T7)：0.5 mg/L BR+0.5% NaCl。重复3次，每处理为一盆3株苗。处理15 d后，选取长势均匀一致的良好植株，测定其幼苗的SOD、POD、CAT酶活性，以及MDA和脯氨酸含量，以筛选在盐胁迫下黄芩幼苗生长的适宜BR处理浓度。

1.3 指标测定

1.3.1 丙二醛(MDA)含量的测定 MDA含量采用TBA(硫代巴比妥酸)法[2]。

MDA含量的计算公式：

MDA含量/(μmol/g)=[6.45×(D532-D600)-0.56D450]×0.015/W

式中：D450表示在450 nm波长下测得的吸光值，D532表示在532 nm波长下测得的吸光度值，D600表示在600 nm波长下测得的吸光度值，W为样品鲜重(g)。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 SOD活性测定采取氮蓝四唑(NBT)法[2]。

SOD活性的计算公式：

SOD总活性/(U/g FW)=(ACK-AE)×V/(W×0.5×ACK)

SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示(U/g)，式中ACK为光照对照管中反应液的吸光值，AE为样品管中反应混合液的吸光值，V为样品液总体积(mL)，W为黄芩幼苗的鲜重(g)。

SOD比活性的计算公式：

SOD比活性/(U/mg)=SOD总活性/蛋白质浓度

1.3.3 过氧化物酶(POD)活性的测定 POD活性的测定采用愈创木酚法[2]，酶液20 μL+反应液3 mL于比色皿中，在470 nm波长下每隔1 min读数吸光度1次，共读3次，以1 min内△A470变化0.01为1个POD酶活性单位(U)。

POD活性的计算公式：

POD活性/[U/(min·g)]= △A470×V/Va/W=△A470×5/0.02/0.5=△A470×500

式中△A470为反应时间内OD的变化值，V为提取酶液总体积(mL)，W为黄芩叶片的鲜重(g)，Va为测定指标时所取用酶液的体积(mL)。

1.3.4 过氧化氢酶(CAT)活性的测定 CAT反应液：H2O25 mL+pH值7.0的磷酸缓冲液20 mL(按1∶4的比例)混匀。

CAT活性的测定：0.1 mL酶液+2.5 mL反应液，在波长240 nm下用石英比色皿比色，每隔1 min读数1次，共读数3次,以1 min内A240减少0.1的酶量为1个CAT酶活性单位(U)。

CAT活性的计算公式:

CAT活性/[U/(min·g)]=△A240×V/Va/W=△A240×5/0.05/0.5=△A240×200

式中△A240为反应时间内OD的变化值，V为提取酶液总体积(mL)，W为黄芩叶片的鲜重(g)，Va为测定指标时所取用酶液的体积(mL)。

1.3.5 脯氨酸含量的测定 脯氨酸含量的测定采用水合茚三酮法[2]：取鲜样0.3 g叶片加入5 mL 3%磺基水杨酸，沸水浴10 min后，冷水浴，吸取上清液2 mL、空白管加入2 mL蒸馏水、2 mL冰乙酸、3 mL酸性茚三酮，沸水浴40 min。将溶液进行冷水浴，各管加入5 mL甲苯，充分振荡，以萃取红色物质，静置液体分层后吸取上层甲苯层，然后用分光光度计测定A520。

脯氨酸含量的计算公式：

脯氨酸含量/(μg/g)=C×V/Va/W

式中C为脯氨酸浓度，V为提取酶液总体积(mL)，W为黄芩叶片的鲜重(g)，Va为测定指标时所取用酶液的体积(mL)。

1.4 数据分析

用Excel 2016和SPSS 18.0软件对数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 油菜素内酯对盐胁迫下黄芩幼苗MDA含量的影响

细胞内MDA含量的高低可以有效地反映胁迫引起的植物细胞膜损伤程度。从图1可知，在0.5% NaCl胁迫下，CK2的黄芩幼苗叶片中MDA含量高于CK1，增加了50.00%。与CK2相比，外施0.1 mg/L BR处理能有效降低MDA含量，但未达显著差异水平；而外施0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L BR处理的MDA含量分别比CK2降低了4.76%、29.76%、36.90%、23.81%，且存在显著性差异(P<0.05)。说明外施不同浓度的BR处理都能不同程度地降低植物细胞的MDA含量，且在0.1～0.5 mg/L BR浓度梯度中，0.4 mg/L BR的处理效果最好。

小写字母表示在0.05水平上的差异显著性，字母不同则差异显著，字母相同则不显著。下同。

2.2 油菜素内酯对盐胁迫下黄芩幼苗抗氧化酶系统的影响

从图2可见，与CK1相比，CK2的黄芩叶片的SOD、POD、CAT酶活性分别提升了43.94%、14.24%和23.05%，说明黄芩幼苗能承受浓度比较低的盐胁迫。与CK2相比，采用不同浓度的BR处理均能不同程度地提高黄芩幼苗叶片中的SOD活性，其中以0.5 mg/L BR处理的效果为最佳，显著提高了63.95%(P<0.05)。与CK2相比，不同浓度的BR处理均能适量提升黄芩幼苗叶片中的CAT活性，其中以0.4 mg/L BR处理的效果最好，CAT酶活性提升了35.39%。在相同的试验处理条件下，黄芩幼苗POD活性的变化规律与SOD类似，即随着BR浓度的上升，酶活性呈现出上升的趋势。

图2 0.5% NaCl胁迫下不同浓度BR对黄芩幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

综上所述，3种保护酶可能一起协同缓解了盐胁迫所造成的活性氧伤害程度，它们的活性均随着外源BR浓度的增加而呈上升趋势的变化，其中CAT活性在0.4 mg/L BR处理时达到最大值，而SOD和POD活性在0.5 mg/L BR浓度处理时达到最大值，可能还需要更高浓度BR处理才能达到峰值，说明在抗氧化酶系统中CAT对BR比较敏感，与SOD和POD活性峰值相比，提前达到CAT峰值。

2.3 油菜素内酯对盐胁迫下黄芩幼苗脯氨酸含量的影响

由图3可知，与CK1相比，CK2的黄芩幼苗植株的渗透调节物质脯氨酸含量呈增长趋势，但差异未达到显著性水平。在经过不同浓度的BR处理后，脯氨酸含量与CK2相比均得到了进一步的提高，其中浓度为0.2、0.3、0.4 mg/L BR处理与CK2相比，差异达显著水平，其脯氨酸含量分别比CK2增加了41.92%、64.14%、65.15%。说明外施不同浓度的BR均能不同程度地增加脯氨酸含量，且在0.1～0.5 mg/L BR浓度梯度中，以0.4 mg/L BR的处理效果最好。

图3 0.5% NaCl胁迫下不同浓度BR对黄芩幼苗叶片脯氨酸含量的影响

3 讨论

植物遭遇逆境胁迫时，活性氧在细胞中不断地积累，膜脂过氧化作用增强，丙二醛含量急剧积累，导致植物体内自由基代谢的平衡被打破，从而伤害植物细胞膜结构和功能的完整性[16]。油菜素内酯是一类重要的外源激素，其生理活性较强，若对其较好应用则可有效提升植物的抗氧化能力和渗透调节能力，调控植物生长发育，以及降低外界因素对植物的迫害可提高植物生理生化特性，保持植物体内的水平衡，有效地缓解盐胁迫造成的损害，促进植株生长和改善植物品质[17]。

在正常条件下，植物体内的活性氧生成与消除一般处于一定的平衡状态中，不易产生膜脂过氧化反应。植物细胞膜脂质过氧化的主要产物之一是MDA，质膜透性的大小和MDA含量是膜损伤和膜过氧化的重要指标[18]。在本研究中，黄芩MDA含量在0.5% NaCl胁迫下增长，说明黄芩幼苗叶片中活性氧急剧产生，超出了细胞自身对活性氧的清除能力，从而导致活性氧在细胞体内累积，膜脂过氧化作用增强，细胞膜系统受到严重破坏。研究表明，BR作用后可以使低氧条件下黄瓜体内的丙二醛含量下降，有效地降低低氧胁迫对黄瓜植株的迫害程度[19]。还有研究表明：在盐胁迫下，BR作用可使水稻体内的丙二醛含量下降[20]。

本研究发现，在0.5% NaCl胁迫下，采用叶面喷施浓度为0.4 mg/L BR可显著降低黄芩体内的MDA含量，这与前人[18-20]的研究结论相似。说明外施BR能不同程度地降低植物细胞膜脂的过氧化作用，维持并保护细胞膜结构的稳定性，从而保证了黄芩植株正常的生长和代谢。

盐胁迫可促使植物细胞体内ROS的产生，加剧了植物体内发生氧化反应，产生具有强氧化性质的各种小分子降解物和膜氧化物，导致膜过氧化和破坏细胞膜完整性，大大降低了保护酶活性[16]。植物在长期进化过程中逐渐形成了包括SOD、POD、CAT等抵抗活性氧伤害的保护酶体系，从而保持植物细胞内活性氧离子代谢处于适量生成与有效清除的动态平衡[21]。其中SOD酶具有较强的氧自由基的消除能力，是植物细胞体内保护酶防御体系的重要组成部分，同时其活性的高低还直接影响了逆境下蛋白质和叶绿素的降解速度与叶片功能的发挥。POD酶在植物细胞体内可将H2O2分解为O2和H2O，保护细胞免受过多过氧化氢的毒害，从而达到清除过氧化氢的作用。CAT酶作为植物细胞体内主要的消除活性氧的酶类，它主要负责去除脂肪酸氧化或光呼吸过程中产生的H2O2，其活性增加有助于有效去除细胞代谢过程中形成的H2O2。植物细胞膜损伤的主要因素是植物活性氧增加引起的不可逆膜脂过氧化。SOD、POD、CAT酶通过协同互作可以高效地消除植物细胞体内多余的自由基，从而提升了植物体适应外界不利因素的能力[22]。

本研究结果与前人[16]的类似：在盐胁迫下，黄芩幼苗的SOD、POD、CAT酶活性上升，喷施不同浓度的BR后，3种酶活性都表现出逐步上升的趋势。对盐胁迫下的黄芩添加BR，不同浓度的BR处理后均可适当提升其抗氧化酶的活性，而本试验中添加BR处理后细胞膜脂过氧化产物MDA含量出现明显的下降趋势，这可能与BR保护作用的发挥和增强抗氧化酶活性的作用而进一步高效消除ROS紧密相关。

在盐胁迫逆境条件下，伴随植物的进化反应，逐步产生了相关的抗逆性生理调节机制，渗透调节是其中一种重要的生理反应，渗透调节物质的水平直接决定了其渗透调节能力的大小[23]。脯氨酸是植物中积累的主要渗透调节剂，其含量的增加有利于提高植物细胞汁的浓度，降低细胞水势，增强植物的吸水能力。同时，脯氨酸也可用作储存的氮源，当植物的胁迫压力减轻时，它也可以参与叶绿素的合成。一旦植物受到胁迫压力，植物体就可以通过积累脯氨酸来增加细胞的渗透调节，当细胞组织的水势降低时，能够维持细胞膨胀压力[24]。

本试验表明：在盐胁迫下，经过BR处理过后的黄芩幼苗叶片细胞内脯氨酸含量与盐胁迫对照相比较呈现上升的趋势，表明BR处理后促进了黄芩体内脯氨酸的积累，进而保持植物细胞体内比较低的渗透势，达到提高植物细胞内溶质的浓度和降低组织水势的作用，能明显地缓解盐胁迫对黄芩植株所造成的损害程度。

4 结论

适当浓度的BR可减轻盐胁迫对黄芩幼苗造成的迫害，与BR能够减轻膜质过氧化作用强度，维持较高浓度的渗透调节物质含量，保护细胞膜系统的结构与功能等生理生化特性关系密切。综上所述，在0.5% NaCl胁迫下，黄芩植株叶片中MDA含量、脯氨酸及抗氧化酶活性都增加；添加适宜浓度的BR能提高叶片SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)保护酶的活性及其脯氨酸含量，并降低MDA含量；在0.1～0.5 mg/L BR浓度梯度中，以0.4、0.5 mg/L BR浓度的处理效果较好。

本试验只初步探究了盆栽条件下添加油菜素内酯对盐胁迫下黄芩生理生化特性的影响；且部分生理指标在BR最大设置浓度才出现峰值，变化规律不是很明显，还有待进一步合理优化BR浓度梯度的设置，并结合黄芩大田生产实践开展不同生育期生理生化变化规律的探讨，以及更深入地研究其生理机制。