CircRNA_23113抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移

王灵霞，严玉兰，袁海涛，蔡烨伟，刘德慧，谷文露，曹碧月

(江苏大学附属人民医院 1.呼吸内科；3.普外科， 江苏 镇江 212002； 2.上海市松江区中心医院 呼吸内科，上海 201600)

在全球范围内，肺癌(lung canccer)是危害人类健康常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均位居首位[1]。近年来，肺腺癌在肺癌中的发病率逐年增加，尽管分子靶向治疗取得了较好的临床效果，但因突变人群阳性率偏低，肺腺癌患者总体5年生存率仍徘徊在20%左右[2]。因此，寻找新的肺腺癌早期诊断生物标志物和治疗靶点是迫切需要的。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类不具有或仅部分有编码功能的共价闭合新型RNA分子，可在哺乳动物体内稳定存在。既往研究证实，circRNA在多种肿瘤中异常表达并诱导癌的发生发展[3]。CircRNA_001569在结肠癌组织及细胞中表达上调，其表达水平与结肠癌患者TNM分期和淋巴结转移相关[4]。本研究通过高通量测序技术筛选出显著差异性表达的环状RNA circRNA_23113，然后检测其在肺腺癌组织、血清及肺腺癌细胞系中的表达水平，并构建circRNA_23113过表达载体，对肺腺癌细胞的增殖和迁移生物学功能进行体外水平研究和初步机制探索，以期明确肺腺癌新型分子靶标，为临床诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料：选取2019年1月至2020年1月在江苏大学附属人民医院接受手术切除的肺腺癌患者癌组织及癌旁组织标本60对，所有患者均未接受术前化疗或放疗，术中及术后病理均提示肺腺癌；另采集45例肺腺癌患者未治疗前及 45例门诊体检健康者的外周血5 mL于抗凝管内，3 000 r/min离心后收集血清于1.5 mL无酶管，-80 ℃储存备用。该研究经过江苏大学附属人民医院伦理委员会批准(批准号：K-20180043-Y)，并获得参与者签署的知情同意书。

1.1.2 细胞及试剂：人肺腺癌细胞系(A549、H1299、H1975细胞)和人支气管黏膜上皮细胞系(BEAS-2B)(中国科学院细胞库)；胎牛血清、RPMI 1640培养基(Gibco公司)；Trizol及Trizol LS试剂(Ambion公司)；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)；过表达质粒(上海吉凯基因科技有限公司)；Lipofectamine 2000 Reagents(Invitrogen公司)；CCK-8试剂盒、Transwell小室(Corning公司)；兔β-catenin(Abcam公司)；cyclin D1、c-myc、β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养和分组处理：所有细胞用含有10%胎牛血清、含青、链霉素双抗的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。过表达质粒组(OE-circRNA_23113组)和阴性对照组(OE-NC组)使用Lipofectamine 2000 Reagents将质粒转染到H1299和A549细胞中，每次转染6 h后更换培养液。

1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA：按照说明书的实验步骤，使用Trizol及Trizol LS试剂来提取总RNA，反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，荧光定量PCR试剂盒加样后，在Applied Biosystems 7500 实时PCR系统上进行PCR 测定。所有实验重复3次，并采用2-ΔΔCt方法分析circRNA_23113相对表达水平。选择GADPH作为内参。GADPH引物序列为5′-CAGGAGGCATTGCTGATG AT-3′(正向)和5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′(反向)。CircRNA_23113引物序列5′-TCATCTTCACC CAGGTGTC-3′(正向)和5′-TCCTGTGCCATCTCCA ATTC-3′(反向)。

1.2.3 CCK-8法测定细胞活力：通过CCK-8试剂盒评估不同组细胞活力。将相应处理后的H1299和A549细胞(5×103个细胞/孔)接种到96 孔板中继续培养 0、24、48和72 h，然后，将10 μL CCK-8和100 μL完全培养基加入每个孔中，将细胞在37 ℃、5% CO2下再培养1～2 h。最后，使用分光光度计测量450 nm处的吸光度值以代表细胞活力。每组实验设置5个复孔。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞集落形成：将转染的细胞(1×103个细胞/孔)接种在6孔板中。在恒温培养箱中培养10～14 d后，4%多聚甲醛固定30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，用0.1%结晶紫染色菌落30 min，蒸馏水清洗干净晾干后使用Image J软件进行克隆细胞团计数。克隆形成率(%) = (克隆团数/接种细胞总数)×100%。

1.2.5 细胞划痕实验检测细胞迁移：用细胞划痕实验评估肺腺癌细胞的迁移能力变化。待6孔板细胞铺满90%以上时，10 μL 移液枪头与直尺垂直在细胞培养板内划痕，每孔穿过5条线，划痕后用PBS漂洗细胞3次，清除划掉的贴壁细胞，加入无血清培养基，同时用OE-NC质粒或circRNA_23113过表达质粒转染，观察拍照后计为0 h，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，再次取样观察、倒置荧光显微镜下拍照。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移：通过Transwell小室迁移实验检测肺腺癌细胞的迁移能力。将转染24 h后的细胞消化后，用200 μL 无血清培养基重悬细胞(5×104个细胞/孔)接种在Transwell(不含基质胶)上层小室内，在下层小室中添加800 μL含有10% FBS的培养基。然后在37 ℃、5% CO2培养箱中温育24 h 后取出，弃去小室中的培养液，医用棉签轻柔擦拭小室上层内侧未迁移的细胞，用PBS清洗3次后用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，PBS漂洗干净后倒扣在超净台内风吹晾干，最后在倒置荧光显微镜下拍照并使用Image J软件计数。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达：使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取蛋白质。通过10%的SDS-PAGE分离目标蛋白质,350 mA 110 min转移到PVDF膜上。3% BSA封闭2 h，并在4 ℃下与一抗孵育过夜。兔β-catenin(1∶500)，cyclin D1、c-myc(1∶1 000)。然后，将膜与山羊抗兔二抗(1∶5 000)在37 ℃下孵育2 h。β-actin(1∶1 000)作为内参对照。使用Image J软件分析目标条带。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CircRNA_23113的筛选

筛选出在肺腺癌与癌旁组织中具有显著差异性表达的环状RNA circRNA_23113(图1)。

图1 高通量测序结果Fig 1 High-throughput sequencing results

2.2 CircRNA_23113在肺腺癌组织、血浆和细胞系中显著下调

CircRNA_23113在60例肺腺癌组织中的表达量显著低于癌旁组织(P<0.001)；肺腺癌患者血浆中circRNA_23113表达水平低于健康体检者(P<0.001)，circRNA_23113在肺腺癌细胞系H1975、H1299、A549的表达水平均低于正常支气管黏膜上皮细胞BEAS-2B(P<0.05)。体外实验选择表达水平最低的A549和较低的H1299肺腺癌细胞进行circRNA_23113过表达质粒转染用于后续实验(图2)。

2.3 过表达质粒转染肺腺癌细胞后circRNA_23113表达水平明显升高

CircRNA_23113过表达质粒转染H1299、A549肺腺癌细胞24h后,OE-circRNA_23113组circRNA_23113的表达水平较OE-NC组明显升高(P<0.05)，表示转染有效(图3)。

A.expression of circRNA_23113 in lung adenocarcinoma tissue n=3)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with normal control group

*P<0.05 compared with negative control group图3 H1299和A549细胞中上调circRNA_23113表达的转染效率Fig 3 Up-regulated transfection efficiency of circRNA_23113 expression in H1299 and A549 cells n=3)

2.4 CircRNA_23113表达抑制肺腺癌细胞增殖

CircRNA_23113过表达质粒转染肺腺癌细胞系H1299、A549后，其细胞活力较OE-NC组显著受到抑制(图4A)。CircRNA_23113过表达后抑制了H1299、A549的克隆形成(P<0.05或P<0.01)(图4B)。

2.5 CircRNA_23113抑制肺腺癌细胞的迁移

肺腺癌细胞系H1299、A549中OE-circRNA_23113组的划痕愈合率明显低于OE-NC组(P<0.01或0.05) (图5A)。肺腺癌细胞H1299、A549中OE-circRNA_23113组的细胞迁移数目明显低于OE-NC组(P<0.05)(图5B)。

2.6 过表达circRNA_23113后，β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达

过表达circRNA_23113后，OE-circRNA_23113组较OE-NC组显著降低了A549和H1299细胞中β-catenin、cyclin D1和c-myc的蛋白表达 (P<0.01或0.001)(图6)。

A.after circRNA_23113 over-expression the cell viability of H1299 and A549 cells was significantly inhibited; B.after circRNA_23113 over-expression the colone formation of H1299 and A549 cells was significantly inhibited; *P<0.05,**P<0.01 compared with negative control group

3 讨论

肺癌是中国癌相关死亡的主要原因。尽管治疗方式取得了进步，肺癌患者的预后仍然很差[5]。肺癌的发病机制复杂，涉及多基因、多因素、多通路，特别是与增殖和迁移相关分子的异常激活。相比线性RNA,circRNA缺乏5′末端帽子和3′末端多聚A尾结构，不易被核糖核酸酶降解，此特殊结构使其比线性RNA更易稳定存在[6]。CircRNA与肿瘤的增殖、侵袭和凋亡密切相关，具有为个体化治疗确定敏感的生物标志物以改善临床结局的潜力[3]。如circ_0007385在非小细胞肺癌组织和细胞中表达上调，可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，且该基因敲除后可降低异种移植肿瘤的生长[7]。有研究[8]发现，在用肉桂醛处理非小细胞肺癌细胞后，细胞中hsa_circ_0043256表达上调，发挥显著的抑癌作用抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。本研究结果表明circRNA_23113在肺腺癌组织、血清及细胞中低表达。通过构建过表达质粒，上调H1299、A549细胞中circRNA_23113表达水平后，利用CCK8法、克隆形成、细胞划痕和Transwell小室迁移实验观察到circRNA_23113可作为抑癌基因显著抑制肺腺癌细胞增殖和迁移。肿瘤的发展与肿瘤细胞的无限增殖、侵袭和转移密切相关。β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白分子的异常表达，参与癌细胞分化、侵袭和转移[9]。研究证实circ_001569通过激活Wnt1、TCF4和β-catenin的蛋白表达水平促进了A549和H1299细胞的增殖[10]。上调circ-ITCH抑制了cyclin D1和c-myc的蛋白表达，减弱了乳腺癌细胞的增殖和侵袭[11]。本研究须在H1299、A549细胞中转染circRNA_23113过表达质粒后，通过蛋白质印迹法证实circRNA_23113过表达后抑制β-catenin、cyclin D1以及 c-myc蛋白表达。这与肺癌发生发展中β-catenin、cyclin D1以及c-myc低表达后，肺癌细胞的增殖和迁移受到抑制相一致[12]。

A.after circRNA_23113 over-expression, the scratch healing rate of H1299 and A549 cells was significantly reduced; B.after circRNA_23113 over-expression, the migration number of H1299 and A549 cells was significantly reduced；*P<0.05, **P<0.01 compared with negative control group

综上所述，本研究证实circRNA_23113在肺腺癌组织、血清及细胞中低表达和肿瘤的恶性生物学行为密切相关，并且circRNA_23113抑制β-catenin、cyclin D1以及c-myc的表达可能参与细胞恶性生物学行为的调控。因此circRNA_23113有望成为肺腺癌预后判断的一个新型生物标志物，进一步探究circRNA_23113调控肺腺癌细胞增殖和转移的具体机制为肺腺癌的早期诊断和治疗方案的确定具有显著的指导意义。

*P<0.01,**P<0.001 compared with negative control group图6 过表达circRNA_23113后，β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达水平Fig 6 Expression levels of β-catenin, cyclin D1 and c-myc after over-expression of circRNA_23113 n=3)