沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗生长及黄芪皂苷合成相关基因表达的影响

姜仕林，赵伟琼，苗莉云，刘婷，宋发军，张鹏*

（1 中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074；2 山西中医药大学 基础医学院，晋中 030619）

植物内生菌是指存在于宿主植物的健康组织中，且不会损害宿主植物的微生物［1］，研究发现内生细菌具有促进植物生长和药用物质合成等作用［2-3］.黄芪（Astragalus membranaceus，A.membranaceus）是我国传统中药材，黄芪皂苷是其主要药用成分之一［4］.目前，人工种植黄芪已成为黄芪药材的主要来源.有益微生物菌剂具有提高作物产量、改善品质、减少化肥用量等作用［5］.利用有益微生物改良和提高黄芪的人工种植技术，可为规模化和标准化人工种植黄芪的技术开发奠定基础.

本课题组前期分离自5年生重楼根状茎的沙雷氏菌SCR21026对小麦幼苗具有明显的促生作用［6］，为进一步分析沙雷氏菌SCR21026对植物生长的影响，采用黄芪作为研究对象，探讨该菌对黄芪幼苗的生长指标、生理指标以及黄芪皂苷合成相关基因表达的影响.

1 材料与方法

1.1 实验材料

沙雷氏菌SCR21026分离自5年生重楼的根状茎［6］.膜荚黄芪种子由山西中医药大学苗莉云老师提供.Trizol试剂和一步法反转录荧光定量试剂盒购于生工生物工程（上海）公司.引物由武汉奥科鼎盛合成（表1）.

表1 引物序列Tab.1 primer sequences

1.2 沙雷氏菌SCR21026与黄芪幼苗的共培养以及样品采集

（1）将沙雷氏菌SCR21026用LB培养基活化培养过夜后，按照1%转接量转接到新鲜LB培养基中，28℃、150 r·min-1培养5 d，离心收集菌体并用0.9%生理盐水稀释至OD600=1.0，备用.（2）将育苗盘划分为64个5 cm×5 cm的方孔，每孔种植黄芪种子20粒，待黄芪幼苗生长至第5天时，浇灌菌悬液.（3）收集对照组及与沙雷氏菌SCR21026共培养第0天、第5天、第10天和第15天的黄芪幼苗.

1.3 生长指标和生理指标的检测

测量黄芪幼苗的株高、根长和鲜重.采用植物赤霉素（GA）、玉米素（ZT）、吲哚乙酸（IAA）、可溶性蛋白、脱落酸（ABA）和乙烯合成酶的ELISA试剂盒（江苏晶美）分别检测黄芪幼苗中相关成分的含量或活性；采用过氧化物酶（POD）活性及可溶性淀粉、可溶性糖和丙二醛（MDA）的检测试剂盒（北京索莱宝）分别检测黄芪幼苗中相关成分的含量或活性.采用SPSS 23.0软件中Wilcoxon符号秩和检验方法进行组间差异性分析.

1.4 黄芪皂苷合成相关基因表达的检测

用Trizol试剂分别提取黄芪幼苗的总RNA，采用一步法反转录荧光定量试剂盒合成cDNA，采用表1所示引物并利用qRT-PCR分别分析黄芪幼苗中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductaseA，HMGR）、异戊二烯焦磷酸异构酶（isopentenyl pyrophosphate isomerase，IDI）、法 呢 基 焦 磷 酸 合 酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）、鲨烯合酶（squalene synthases，SS）、鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE）、环阿尔庭烷合酶（cycloartenol synthase，CAS）等基因的表达情况，并以18S rRNA基因做内参，采用Livak法［7］计算6个关键酶基因的相对表达量.

2 结果与分析

2.1 沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗生长的影响

实验第5天，实验组的根长和株高比对照组分别提高了53.00%和13.46%，差异极显著（P<0.01），而鲜重与对照相比差异较小；第15天的黄芪幼苗的根长、株高和鲜重与对照相比均没有显著差异（图1），表明沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗的促生作用主要在共培养初期，且主要影响株高和根长.

图1 沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗生长的影响（**：P<0.01；***：P<0.001；n=3）Fig.1 Effect of Serratia sp.SCR21026 on the growth of A.membranaceus seedlings（**：P<0.01；***：P<0.001；n=3）

2.2 沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗生理指标的影响

施加沙雷氏菌SCR21026后，对黄芪幼苗生理指标的影响见图2.黄芪幼苗的可溶性糖含量均显著高于对照（P<0.01）（图2（a）），黄芪幼苗的可溶性淀粉含量后期也显著高于对照组（P<0.01）（图2（b））.可溶性蛋白是植物重要的渗透调节物质，为植物抵御各种不良环境提供生理基础［8］.施菌后幼苗中可溶性蛋白含量在第5天时高于对照（图2（c）），之后则低于或约等于对照，表明沙雷氏菌SCR21026主要在施菌后早期，促进黄芪幼苗的可溶性蛋白含量的增高.

MDA含量可用来衡量植物的受损害程度，植物受到胁迫的初期其含量会增加，但随着胁迫时间的增加，MDA含量呈下降趋势［9］.实验组MDA含量均高于对照（P<0.05）（图2（d）），表明在本研究检测时间范围内，沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗一直产生胁迫作用.POD可清除过剩的自由基，实验组黄芪幼苗的POD活力均高于对照組（P<0.05）（图2（e）），表明施加沙雷氏菌SCR21026后激发了宿主的抗逆防卫系统.

图2 沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗生理指标的影响（*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；n=3）Fig.2 Effect of Serratia sp.SCR21026 strain on the physiological indexes of A.membranaceus seedlings（*：P<0.05；**：P<0.01；

GA是植物生长发育过程中的关键激素［10］.ZT可促进植物细胞分裂，延缓植物衰老［11］.乙烯合成酶是乙烯合成途径中的关键酶，调节植物发育和逆境反应［12］.施 加 沙 雷 氏 菌SCR21026后，沙 雷 氏 菌SCR21026对黄芪幼苗的GA和ZT合成以及乙烯合成酶活性表现为先抑制后促进［图2（f）（g）（h）］.其中，施菌后第5天的黄芪幼苗的GA含量与对照存在显著差异（P<0.05）；而ZT含量和乙烯合成酶活性则在3个检测时间点都与对照没有显著差异，表明施加沙雷氏菌SCR21026对其含量和活性影响不大.

IAA对植物的种子发芽和生长具有促进作用，ABA主要作用是抑制植株生长，增加植株的抗逆性［11］.施加沙雷氏菌SCR21026后，黄芪幼苗的IAA和ABA含量均在第5天高于对照，之后含量降低［图2（i）（j）］，预示沙雷氏菌SCR21026主要在施菌早期促进黄芪幼苗中IAA和ABA含量的提高，但在3个检测时间点都与对照没有显著差异，表明施加沙雷氏菌SCR21026对其含量影响不大.

2.3 沙雷氏菌SCR21026对黄芪皂苷合成相关基因表达的影响

黄芪皂苷合成途径中，HMGR催化羟甲基戊二酰CoA形成甲羟戊酸；IDI催化二甲基烯丙基二磷酸酯（DMAPP）和异戊二烯焦磷酸（IPP）相互转化；FPS催化二甲基烯丙基二磷酸酯（DMAPP）和异戊二烯焦磷酸（IPP）形成法呢基焦磷酸（FPP）；SS催化法呢基焦磷酸（FPP）形成鲨烯；SE催化鲨烯形成2，3-氧鲨烯；CAS催化2，3-氧鲨烯形成环阿屯醇，再由不同种类的P450或糖基转移酶合成各种黄芪皂苷［13］.施加沙雷氏菌SCR21026后，在第15天，黄芪幼苗的HMGR相对表达量是对照的103.33倍；IDI相对表达量是对照的42.12倍；FPS相对表达量是对照的24.83倍；SS相对表达量是对照的66.57倍；SE相对表达量是对照的35.00倍；CAS相对表达量是对照的43.00倍（表2），表明施菌后第15天的黄芪幼苗的6个关键酶基因的表达量远高于对照，预示沙雷氏菌SCR21026在施用后第15天或其后对黄芪皂苷合成相关基因的表达具有显著的促进作用（P<0.05）.

表2 沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗中黄芪皂苷合成相关基因表达的影响（*：P<0.05，n=3）Tab.2 Effect of Serratia sp.SCR21026 on the expression levels of six genes involved in astragalus saponins biosynthesis（*：P<0.05，n=3）

3 讨论

重楼内生菌具有促进植物种子萌发［14］、生长［15］和药用物质合成［16］等作用.本研究发现分离自重楼的沙雷氏菌SCR21026对黄芪幼苗的生长具有一定的促进作用，尤其在施菌前期效果显著，如在施菌后第5天黄芪幼苗的根长和株高分别增长53.00%和13.46%.辛中尧等发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B1、B2对黄芪具有促生增产作用，增产率分别为12.50%和16.25%，还能够促进根的生长，提高黄芪的品质［17］.韩笑发现接种内生细菌D1和D2后，水稻幼苗的可溶性蛋白等含量以及SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性显著提高，MDA含量则明显低于对照，生长得到促进［18］.本研究亦发现沙雷氏菌SCR21026对可溶性糖、可溶性淀粉、MDA、GA和可溶性蛋白含量及POD活力的影响较大，预示沙雷氏菌SCR21026可能通过影响这些生理指标的变化从而促进黄芪幼苗的生长.

一些内生菌具有促进宿主植物的药用成分积累的作用，如滇重楼内生菌（人参生柱隔孢和木霉菌）能促进滇重楼组培苗中皂苷类活性成分的积累，从而提高宿主品质［16］.耐冷草假单胞菌（Pseudomonas poae s61）能够促进黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷的合成［19］.本研究分析了施加沙雷氏菌SCR21026后对黄芪幼苗中6个黄芪皂苷合成相关基因表达的影响，发现施菌后第15天时，HMGR、IDI、FPS、SS、SE、CAS基因的表达量远高于对照，沙雷氏菌SCR21026能够促进黄芪皂苷合成过程中的关键酶基因的表达，预示沙雷氏菌SCR21026具有潜在促进黄芪皂苷合成的作用.