单月桂酸甘油酯对猪流行性腹泻病毒感染仔猪肝脏抗氧化功能和脂代谢基因表达的影响

2022-01-20朱哲坤谭子涵王帅杰汪曼丽侯永清

中国畜牧杂志 2022年1期

朱哲坤，谭子涵，王帅杰，宁楠，汪曼丽，王蕾,2，侯永清,2*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北武汉 430023）

猪流行性腹泻病毒感染（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）是造成猪流行性腹泻的重要病原体之一，其传染性对养猪业生产造成巨大威胁。本课题组前期已成功建立PEDV感染仔猪肠道损伤模型，在此模型下，PEDV感染会造成仔猪严重腹泻并破坏仔猪肠道形态结构，进而影响仔猪小肠的屏障功能。近年来研究发现，肠道、肝脏和血液代谢物之间能相互作用，这种相互作用称为“肠肝轴”作用。而肝脏是多功能器官，参与脂代谢、消化、蛋白质合成。如果肝脏受损，脂质代谢功能将受到影响，所以寻找一种能有效保护肝脏的物质非常重要。

单月桂酸甘油酯（Monolaurin，ML）可以通过化学合成，也天然存在于母乳和椰子油等物质中。月桂酸的碳链长度为12，是中链脂肪酸的一种。动物生产中，ML可以为初生仔猪供能，提高仔猪生长性能，降低肉鸡腹脂，调节脂肪代谢。ML有很强的抗病毒能力，如林观谊研究发现，日粮中添加ML能有效防控PEDV的传播，减少哺乳仔猪的发病率；在对蓝耳病病毒带毒母猪日粮中添加ML能够有效改善母猪健康，且未检测到仔猪带毒；ML对单纯性疱疹病毒、艾滋病毒也有明显抑制作用。ML对调节体内脂代谢同样具有良好的作用，有研究表明日粮中添加ML可以改善仔猪脂肪代谢，ML还可以通过脂质代谢和甘油磷脂代谢调节对高脂饮食的小鼠起到抗肥胖作用。本文旨在研究ML对PEDV感染仔猪肝脏的保护作用，为ML在早期断奶仔猪生产中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料猪流行性腹泻病毒（PEDV，YN株）由华中农业大学微生物重点实验室馈赠；ML购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验动物与试验设计试验选用24头平均体重（2.35±0.16）kg的7日龄健康断奶仔猪（杜×长×大），随机分为3个处理组（对照组、PEDV组、PEDV+ML组），每组8个重复，每个重复1头猪。正试期8 d，各组基础日粮一致。在试验第0～7天，对PEDV+ML组仔猪进行口腔灌服ML（与人工乳配成悬浊液，每天灌服剂量为100 mg/kg·BW），对照组与PEDV组仔猪口腔灌服等体积的人工乳。于试验第5天，用口腔灌服的方式对PEDV组与PEDV+ML组仔猪进行PEDV感染（剂量为：1×10TCID），对照组仔猪口腔灌服等体积的PBS溶液。于试验第7天晚上断水断料，第8天早上空腹称重，然后用戊巴比妥钠（50 mg/kg·BW）肌肉注射麻醉，麻醉完全后屠宰取样。

1.3 试验日粮试验日粮使用的市售奶粉（商品名：纽瑞滋全脂奶粉），日粮的组成及营养水平为每100 g含能量2131 KJ、蛋白质24.2 g、脂肪28.6 g、碳水化合物38.9 g、钠264 mg和钙875 mg。

1.4 饲养管理猪舍为密闭猪舍，试验前对猪舍及猪笼彻底清洗并消毒。对照组仔猪饲养在一间猪舍，PEDV组与PEDV+ML组仔猪饲养在另一间猪舍的不同猪栏，两个猪舍建筑设计与室内环境控制完全一致，严格控制两个猪舍不交叉感染。试验期间每天清扫猪舍2次，并用联灭、百盛、百毒杀等消毒液交替消毒。维持室温在22～25℃；每天饲喂5次，分别在08:00、12:00、15:00、18:00、22:00饲喂，早中晚3个时间点各增喂1次温水。

1.5 样品采集试验结束当天将仔猪麻醉后屠宰，迅速取出肝脏，切取0.5 cm左右的肝脏组织块，用冷生理盐水冲洗2～3次，放入4%的多聚甲醛溶液进行固定。经石蜡包埋、苏木素-伊红（HE）染色后制成肝脏病理切片。此外，取肝脏边缘部分并切成小块，放入EP管立即置于液氮中冷却，然后将其转移到-80℃冰箱中冻存，待测。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 肝脏形态结构观察用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统对肝细胞密度和规则程度等形态特征进行观察。

1.6.2 肝脏蛋白质代谢指标用John Chandler法提取组织匀浆液中的DNA和RNA，用紫外吸收法测定提取液中RNA和DNA水平。使用总蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定肝脏总蛋白。

1.6.3 肝脏抗氧化指标肝脏过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢（HO）和丙二醛（MDA）含量均使用南京建成生物工程研究所试剂盒检测。

1.6.3 肝脏抗氧化和脂质代谢相关基因相对表达量的检测采用TRIzol（TaKaRa，大连）一步抽提法，提取肝脏研磨样品中的总RNA，在保证RNA纯度合格（A260：A280=1.7～2.1，且A260：A230＞2）且未降解的前提下，根据PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大连）试剂盒的方法步骤对RNA进行反转录，合成cDNA，然后再采用实时荧光定量PCR（qPCR）的方法，以核糖体蛋白L4（）基因为内参，对肝脏Ke IcH 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（）、肝脏核因子E2 相关因子 2（）、谷胱甘肽硫转移酶2（）、血红素加氧酶1（）、脂肪酸结合蛋白1（）、载脂蛋白A4（）、载脂蛋白C2（）、脂肪酸合成酶基因（）基因进行检测。各个基因qPCR的数据结果统一参照Fu等的方法进行统计分析。检测的基因序列见表1。

表1 检测基因对应的上下游引物序列

1.7 统计分析试验数据采用SPSS 17.0统计软件中的Duncan′s法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示，以＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 ML对PEDV感染仔猪肝脏形态结构的影响如图1所示，对照组肝小叶分支清楚，小叶结构明显，大小一致，排列规则，中央静脉及中央带肝细胞清晰可见，肝细胞以中央呈放射状排列，清晰的肝血窦少见，肝窦中的椭圆形黑色的为窦性细胞，周边带细胞正常排列，界限清晰，同时可以看到有少量炎性细胞浸润。PEDV组肝细胞排列不规则，出现大面积的细胞空泡化，脂肪变性，部分细胞细胞核变形、溶解。与PEDV组相比，PEDV+ML组肝细胞大小一致，排列规则，且肝脏空泡化程度明显减轻。

图1 ML对PEDV感染仔猪肝脏形态结构的影响

2.2 ML对PEDV感染仔猪肝脏核酸和蛋白质水平的影响从表2可以看出，与对照组相比，PEDV组的肝脏蛋白质含量提高（＜0.05）；与PEDV组相比，PEDV+ML组肝脏蛋白质和DNA含量提高（＜0.05）。

表2 ML对PEDV感染仔猪肝脏核酸和蛋白质水平的影响

2.3 ML对PEDV感染仔猪肝脏抗氧化能力的影响从表3可以看出，与对照组相比，PEDV组的肝脏CAT和SOD活性降低（＜0.05）；与PEDV组相比，PEDV+ML组肝脏SOD的活性提高（＜0.05），肝脏HO和MDA含量降低（＜0.05）。

表3 ML对PEDV感染仔猪肝脏抗氧化能力的影响

2.4 ML对PEDV感染仔猪肝脏相关基因相对表达量的影响由表4可知，与对照组相比，PEDV组肝脏和基因的相对表达量上调（＜0.05）；与PEDV组相比，PEDV+ML组和基因的相对表达量上调（＜0.05），和基因的相对表达量下调（＜0.05）。

表4 ML对PEDV感染仔猪肝脏氧化和脂质代谢相关基因相对表达量的影响

3 讨论

3.1 ML对PEDV感染仔猪肝脏形态结构的影响 Jphn等于1998年提出“肠肝轴”的概念，肠肝轴的各种细胞炎症介质相互作用，相互影响，构成一个复杂的网络。研究表明，PEDV感染严重影响仔猪肠道健康，使机体产生大量的氧自由基使肠道处于氧化应激状态，导致肠道屏障功能受损，同时使肠道促炎细胞因子增加。而肝脏和肠道通过门静脉循环和胆管树相连，肝脏中70%血液是由肠道通过门静脉循环来供应，肝脏会持续暴露于肠道代谢产物中，故PEDV可能可以通过肠肝轴来影响仔猪肝脏的正常结构功能。本试验仔猪肝脏切片显示，对照组肝脏细胞出现少量炎性细胞浸润，可能是由于小猪7 d断奶改用人工饲喂导致的应激；PEDV导致肝细胞出现严重的细胞空泡化，且部分细胞细胞核变形、溶解，而添加ML缓解了肝细胞的这些病变，使细胞形态结构趋于正常。PEDV使仔猪肝脏受到损伤可能是由于PEDV影响肠道脂质转运和代谢相关基因，再通过肠肝轴来影响肝脏的脂质代谢，而补充ML能通过防止控制肝脏代谢的核转录因子PPAR（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor，过氧化物酶体增殖物激活受体）的上调来改善肝脏脂质代谢，在一定程度上缓解仔猪因PEDV处理导致的肝脏损伤。

3.2 ML对PEDV感染仔猪肝脏核酸和蛋白质水平的影响蛋白质影响各种酶的合成、细胞生长，是生命活动的重要承担者等。DNA浓度和蛋白/DNA比值的变化表明转录和翻译过程的改变。DNA浓度反映有丝分裂产生新的细胞的速度，RNA/DNA比值可以衡量细胞的增长速率。本试验结果表明，口腔灌服ML提高了PEDV仔猪肝脏蛋白质和DNA含量，说明添加ML可以促进肝细胞的蛋白合成，代谢加快。

3.3 ML对PEDV感染仔猪肝脏抗氧化能力的影响肝脏MDA是酶与非酶脂质过氧化反应的终产物之一，生物体内自由基的指示物，广泛地作为各种氧自由基损伤机体的指标。SOD活力间接反映了机体清除氧自由基的能力，CAT反映了肝脏清除HO的能力。本试验结果表明，PEDV刺激提高了仔猪肝脏HO含量，降低了CAT和SOD活性，表明PEDV刺激破坏了氧化还原状态的平衡；日粮中添加ML提高了PEDV仔猪肝脏SOD活性，降低了HO和MDA含量，说明ML有提高PEDV仔猪的抗氧化能力。ML可能通过降低氧化产物含量和提高抗氧化相关酶活性来改善仔猪抗氧化能力。有关ML对仔猪肝脏抗氧化能力影响的研究较少，但有研究表明，同为中链脂肪酸的褐藻多糖硫酸酯可以增强体内SOD活性，降低脂质的过氧化程度，清除过多的自由基。Senthilkumar等试验发现鱼肝油萜可以在环磷酰胺引起毒性后使酶类和非酶类抗氧化剂正常化。故ML可以提高PEDV感染仔猪肝脏抗氧化能力。

3.4 ML对PEDV感染仔猪肝脏氧化和脂质代谢相关基因相对表达量的影响信号通路已被证明在抗氧化应激方面发挥着重要作用。本试验研究表明，PEDV感染显著上调了肝脏的相对表达量，而添加ML显著上调了的相对表达量。Luo等研究表明，通过和的激活抑制组织的氧化应激，从而可以减轻由过量服用醋氨酚引起的氧化应激和肝损伤。本试验结果显示，添加ML显著缓解了因PEDV刺激引起的肝脏和基因相对表达量的上调。参与调节脂代谢、糖代谢等多种代谢途径并具有抗氧化和抗炎特性，有研究表明高脂肪饮食或脂肪变性可增加肝脏基因相对表达量。同样的，是一种小的可交换性载脂蛋白，存在于富含甘油三酯的脂蛋白上，其基因表达随着脂质的增加而增加。可能是由于PEDV感染仔猪造成仔猪肝脏脂质代谢异常导致肝脏脂质积累，进而使得和基因的相对表达量上调，而ML则通过调节脂质代谢功能来恢复肝脏和基因相对表达量。