中药注射剂喜炎平对阿奇霉素组织分布的影响

2022-01-19李志勇孙发鑫许晓蒙郭文娜冯莹莹

烟台大学学报（自然科学与工程版） 2022年1期

李志勇,孙发鑫,许晓蒙,郭文娜,冯莹莹,袁梦,许卉

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东烟台 264005)

小儿支原体肺炎是由支原体感染所造成的肺部急性炎症,临床表现为持续剧烈咳嗽、发热、畏寒等[1]。大环内酯类抗生素阿奇霉素(AZM)是治疗支原体肺炎的首选抗菌药物,其在体内吸收迅速,达峰时间短,半衰期长,生物利用度高,分布广泛,组织浓度明显高于同期血药浓度[2]。虽然AZM可在一定程度上改善临床症状,但长期使用可增加药物耐药性,易出现病情反复发作、增加肺炎相关并发症发生风险,因此寻找小儿支原体肺炎更加有效的治疗方案成为新的难题[3]。

近年来中药制剂与阿奇霉素联用被广泛推荐用于治疗小儿支原体肺炎,通过发挥药物整体优势,既显著提高疗效,又减少不良反应的发生[4-6]。喜炎平注射液(XYP)为纯中药制剂,主要成分为穿心莲内酯总磺化物,具有良好的解热止咳、抗炎、抗菌、抗病毒的作用,主要用于治疗支气管炎,肺炎,细菌性痢疾等[7]。临床研究显示,XYP无论是单用还是与其他抗菌药物联用对小儿支原体肺炎均取得较好效果[8-9]。XYP与AZM联合使用可显著减轻患儿的炎症反应,缩短了症状消失时间和住院时间,提高了临床疗效[10]。本实验将XYP与AZM联合应用于肺炎模型大鼠,通过建立的LC-MS/MS方法考察AZM在大鼠心、肝、脾、肺和肾组织中的分布,探究XYP对AZM在大鼠体内组织分布的影响,为制定合理的临床应用方案提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及动物

Agilent 1100高效液相色谱仪;Thremo TSQ Quantum Access三重四级杆质谱仪;TGL-20W台式高速冷冻离心机(上海湘仪实验室仪器开发有限公司);实验室注射泵TYD02-04-CE(保定雷弗流体科技有限公司);XS-105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

喜炎平注射液(江西青峰药业有限公司),批号:2019092103;注射用阿奇霉素(山东罗欣药业集团有限公司),批号:518013152;阿奇霉素对照品(中国食品药品检定研究院),批号:130593-201303;阿霉素对照品(北京偶合科技有限公司);肺炎克雷伯标准菌株(CMCC(B)46117;中国食品药品检定研究院);甲醇、乙腈均为色谱纯;其余试剂均为市售分析纯;实验用水为娃哈哈纯净水。

健康雄性SD大鼠12只,体重200±20 g,济南朋悦实验动物繁育有限公司实验动物中心提供[生产合格证书:SCXK(鲁)2014-0007],实验前1周进行适应性喂养。动物相关的所有实验均经烟台大学实验动物伦理委员会审核并批准。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 AZM标准溶液:精密称取阿奇霉素对照品1.05 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,储备液质量浓度为0.105mg/mL。放置4 ℃贮藏,备用。

阿霉素标准溶液:精密称取阿霉素对照品5.07 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,储备液质量浓度为507 μg/mL,再逐级稀释成质量浓度为250 ng/mL的内标溶液,备用。

1.2.2 大鼠细菌感染性肺炎模型建立实验动物为SD雄性大鼠,采用气管注入法建立大鼠肺炎模型[11-12]。将大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100 g)使其麻醉,滴入0.05mL处于对数生长期的肺炎克雷伯菌(4×107CFU/mL),接种后立即竖立于固定台,保持直立位约20 s,以保证接种菌液受重力作用流入支气管和肺泡内进行肺部感染。造模前大鼠全血中白细胞与中性粒细胞的数目分别为(8.61±1.11)×109个/L、(3.02±1.27)×109个/L,造模后全血中白细胞数目及中性粒细胞数分别为(22.07±5.32)×109个/L、(15.55±3.92)×109个/L,显著增加为2.6倍和5.1倍,肺组织经HE染色显示有大量炎性细胞浸润,表明造模成功。

1.2.3 动物分组与给药方案根据文献,AZM在人临床上的给药剂量为10.0 mg/kg,换算到大鼠体内的给药剂量为63.0 mg/kg[13],结合体外抗炎实验结果,最终确定AZM和XYP的联用配比为1∶1。

造模成功的大鼠给药处理前禁食不禁水12 h,称重、编号后随机分为对照组和实验组(n=6),分别经尾静脉静脉注射给予AZM和/或XYP,剂量均为63.0 mg/kg,每日1次,连续给药1周。

1.2.4 血浆样品采集与预处理末次给药24 h后,断尾取血0.5 mL于肝素化EP管中,轻轻振摇,4 ℃下离心10 min(8 000 r/min),移取上清液于洁净的EP管中,-20 ℃保存。

取血浆50 μL至EP管中,加入内标溶液(250 ng/mL)50 μL、0.02 mol/L Na2CO3300 μL和乙酸乙酯-异丙醇(95∶5)2 mL,涡旋混合2 min,4 ℃下离心10 min(12 500 r/min)。取上清液至洁净EP管中,37 ℃水浴中氮气流吹干,加入流动相200 μL复溶,涡旋离心,取上清5 μL,进样检测。

1.2.5 组织样品采集与预处理末次给药24 h后,脱颈椎处死大鼠,取出心、肝、脾、肺、肾,用生理盐水洗净组织表面浮血,滤纸吸干残余液体,称重,-20 ℃保存待测。

精密称取适量组织样品置匀浆机中,按照质量:体积为1∶5的比例加入纯水,充分匀浆,4 ℃离心10 min(3 600 r/min),取组织匀浆上清液50 μL至EP管中,依次加入内标溶液(250 ng/mL)50 μL、0.02 mol/L Na2CO3300 μL和乙酸乙酯-异丙醇(95∶5)2 mL,涡旋混合2 min,4 ℃离心10 min(12 500r/min)。取上清液至洁净EP管中,37 ℃水浴中氮气流吹干,加入流动相200 μL复溶,涡旋离心,取上清5 μL,进样检测。

1.2.6 色谱条件色谱柱:WATERS,ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×50 mm,1.7 μm);流动相:0.1%甲酸水-乙腈(30∶70);柱温:30 ℃;流速:0.2 mL/min;进样量:2 μL。

1.2.7 质谱条件电喷雾离子源(ESI),正离子方式检测,扫描方式为单反应监测(SRM),用于定量分析的离子反应分别为AZMm/z749.20→591.04,内标阿霉素m/z543.90→396.61,离子喷射电压4 kV,毛细管温度350 ℃,鞘气压力30 psi,辅助气压力5 psi,AZM和内标的碰撞能量(CE)分别为35、17 eV。

1.2.8 方法学考察参考中国药典(2015版)生物样品定量分析方法验证的指导原则以及文献[14-16]进行了方法学考察,主要包括专属性、线性范围和定量下限、精密度及准确度、回收率及基质效应、稳定性。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性取空白血浆和组织匀浆、含AZM和内标的空白血浆和组织匀浆以及给药后的大鼠血浆和组织匀浆,按“1.2.4”和“1.2.5”项下方法处理后进行检测。结果显示,血浆和组织中的内源性物质不干扰AZM的测定,方法的专属性良好(图1,仅以肝为例)。

图1 LC-MS/MS测定大鼠肝中AZM质量浓度的典型色谱图Fig.1 Typical chromatograms of LC-MS/MS for the determination of AZM

2.1.2 线性范围与定量下限取空白血浆制成含AZM质量浓度分别为0.1,1,10,20,50,100 ng/mL的系列样品,加入内标(250 ng/mL)50 μL,按“1.2.4”项下方法处理后测定,记录色谱图,以待测药物浓度为横坐标,待测物与内标的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算,求得回归方程(表1)。结果表明:血浆中AZM在0.1～100 ng/mL范围内线性关系良好(r>0.995 4),最低定量浓度为0.1 ng/mL。

取空白组织匀浆制成含AZM分别为1,10,20,50,100,200,500 ng/mL的系列样品,加入内标(250 ng/mL)50 μL,按“1.2.5”项下方法处理后测定,记录色谱图,以待测药物浓度为横坐标,待测物与内标的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算得回归方程(表1)。结果表明:脾、肺、肾组织中AZM测定的线性浓度范围为1～100 ng/mL,肝、心组织中AZM测定的线性浓度范围分别为1～500 ng/mL和1～200 ng/mL(r>0.99),各组织的最低定量限均为1 ng/mL。

表1 血浆和组织中AZM测定的标准曲线Tab.1 Standard curves for quantification of AZM in plasma and various tissue samples

2.1.3 精密度与准确度按样品处理方法平行制备低、中、高质量浓度含药血浆和组织质控样品各9份(n=3份/批×3批),进样检测后计算日间、日内精密度和准确度,结果见表2。测定结果表明:低、中、高质量浓度AZM测定的日内、日间精密度(RSD)均小于10.8%,准确度(RE)均小于10.1%,满足生物样品定量分析方法要求。

表2 AZM在血浆和组织中的精密度和准确度Tab.2 The precision and accuracy of AZM in plasma and tissues

2.1.4 回收率与基质效应按样品处理方法制备低、中、高质量浓度的质控样品,进样检测后的目标分析物的峰面积为A;将空白血浆和组织匀浆按样品处理方法进行预处理,再加入AZM和内标的标准溶液进样分析,得到目标分析物的峰面积为B;制备相应质量浓度的标准溶液,得目标分析物的峰面积为C。以“(A/B)×100%”计算提取回收率,以“(B/C)×100%”考察基质效应。结果如表3所示,AZM在血浆和组织中的回收率均大于80%,均无明显的基质效应,符合生物样品定量分析的要求。

表3 AZM在血浆和组织中的回收率和基质效应Tab.3 The recovery rate and matrix effect of AZM in plasma and tissues

表3(续)

2.1.5 稳定性取空白大鼠血浆和组织匀浆,分别加入低、中、高质量浓度的标准溶液配制质控样品,考察样品在自动进样器放置24 h、室温放置2 h、3次冻融循环及在-20 ℃下放置14 d的稳定性,每种条件下每浓度3个平行样本。实验结果如表4所示,AZM在不同条件下的RSD均小于9.7%,表明血浆和组织样品的AZM在上述条件下均具有良好的稳定性。

表4 不同条件下AZM在血浆和组织中的稳定性Tab.4 The stability of AZM in plasma and tissues under different conditions

2.2 组织分布研究

根据预实验结果,血浆和各组织中的AZM浓度均远高于标准曲线的范围,因此对血浆和组织匀浆进行稀释,血浆稀释5 000倍,心稀释2 000倍,肝稀释10 000倍,脾、肺、肾均稀释20 000倍。肺炎模型大鼠联合给药与单独给药后的AZM组织分布测定结果见图2。结果表明:与对照组相比,实验组AZM在肝中的质量分数显著降低(P<0.05),在血浆和其他组织中未见有显著性差异。研究结果表明,XYP可促进AZM在大鼠肝中的代谢,从而显著降低其在肝脏的药物蓄积,有利于改善AZM长期用药造成的肝损伤。

与对照组相比,*P<0.05。图2 给药后AZM在各组织的分布Fig.2 Distribution of AZM in various tissues after administration

3 讨论

近年来小儿支原体肺炎发病率居高不下,婴幼儿为主要发病人群,占儿童社区获得性肺炎的10%～40%[17]。基于前期的系统评价和Meta分析发现,喜炎平注射液和阿奇霉素的联合方案可能是临床上治疗小儿支原体肺炎的有效和安全的方法,为二者联用提供了强有力的理论依据[18]。前期的体内药效学研究结果表明，建立的肺炎克雷伯菌感染的大鼠肺炎模型经过多次给药之后,XYP联用AZM显著抑制肺组织中肺炎克雷伯菌的增殖,降低肺组织中菌落的数量,减轻肺组织的病变程度,显示出良好的抗炎效果,在体内具有明显的药效学相互作用。

本实验建立了一种灵敏、快速、高效的LC-MS/MS方法,测定肺炎大鼠血浆和组织内的AZM浓度,考察XYP对AZM在大鼠体内各组织的影响。研究表明,与对照组相比,实验组显著降低AZM在肝组织中的药物蓄积,推测可能的原因是XYP能通过影响肝脏的药物代谢酶从而促进AZM的代谢,有利于缓解长期使用AZM对肝的损伤。