不同方法提取马氏珠母贝外套膜胶原蛋白理化性质比较

林海生，王 雯，秦小明，曹文红，章超桦，高加龙，郑惠娜，陈忆宾，伍 彬

不同方法提取马氏珠母贝外套膜胶原蛋白理化性质比较

林海生1,2,3，王 雯1，秦小明1,2,3，曹文红1,2,3，章超桦1,2,3，高加龙1,2,3，郑惠娜1,2,3，陈忆宾4，伍 彬1,2,3

（1. 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2. 广东省水产品加工与安全重点实验室 // 广东普通高等学校水产品深加工重点实验室 // 国家贝类加工技术研发分中心 (湛江) // 南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东 湛江 524088；3. 大连工业大学，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034；4. 海南盛美诺生物技术有限公司，海南 澄迈 571925）

【目的】系统分析不同方法提取的马氏珠母贝（）外套膜胶原蛋白的理化性质及生物学功能。【方法】分别采用酸-酶法和热水法从外套膜中提取得到两种胶原蛋白（A-PSC(Pm)和HSC(Pm)），对其氨基酸组成、微观结构及热变性温度等理化特性进行比较分析。【结果】HSC(Pm)提取率高于A-PSC(Pm)；HSC(Pm)中，Gly、Glu与Arg相对含量较高，分别为20.16%、17.57%和10.07%；而A-PSC(Pm)中，Glu、Asp与Arg相对含量为19.67%、11.63%和10.07%；紫外光谱和红外光谱分别显示，两种胶原蛋白均在220 nm左右有强吸收峰，且具有典型的胶原蛋白特征带（酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带）；扫描电镜结果显示，A-PSC(Pm)呈致密多孔网状结构，HSC(Pm)则基本为薄片状；DSC分析结果表明，HSC(Pm)具有更好的热稳定性。【结论】酸-酶法及热水法提取的胶原蛋白均具有类V型胶原蛋白特性，其结构特征及其理化性质均存在差异，可根据需求选择特定的胶原蛋白提取方法用以开发不同类型的产品。

马氏珠母贝；外套膜；胶原蛋白；理化性质；提取方法

胶原蛋白为细胞外基质的一种结构蛋白质，是动物细胞合成的一种高分子蛋白质。胶原单体的典型重复单位是（Gly-X-Y），其中X和Y通常为脯氨酸和羟脯氨酸[1]。到目前为止，至少有29种胶原蛋白被鉴定并命名（I-XXIX型）[2]。每一种类型的胶原蛋白的氨基酸序列、结构和功能都有显著的差异[3]。因其能提供弹性、稳定性和支持组织[4]，胶原蛋白被广泛应用到医疗器械、药品、化妆品、日用化学品工业、功能性食品制造等多领域。现阶段，由于哺乳动物源胶原蛋白受到口蹄疫（FMD）、牛海绵状脑病（BSE）、传染性海绵状脑病（TSE）等多种感染性疾病的威胁[5]，水产动物副产物逐渐成为哺乳动物源胶原蛋白的良好替代品。

目前，水生生物源胶原蛋白研究主要集中在鱼类、蛙类、海洋无脊椎动物（软体动物、海参、腔肠动物等）等，其氨基酸组成特性差异较大，且其酶解产物含生物活性多样[6-9]。研究表明，双壳贝的外套膜胶原蛋白含量较高[10]，本团队前期研究证实，贝类外套膜酶解产物具有创伤修复等生物活性[11]。但目前系统研究贝类胶原蛋白的理化性质及生物学功能的文献较少。

马氏珠母贝（）是用于培养海水珍珠最重要的双壳贝类之一，广泛分布于我国南方各省，特别是海南、广东、广西等地[12]。珍珠贝经过采珠处理后，其贝壳、外套膜软体组织等加工副产物通常未进一步加工利用而被丢弃，少量鲜销食用或加工生产饲料，并没有充分开发其潜在价值[13]。马氏珠母贝外套膜作为插核形成珍珠囊的重要组织，富含胶原蛋白、糖类和矿物质等。为了提高珍珠贝外套膜的附加值，本研究选用外套膜组织为原料，采用两种不同提取方法制备胶原蛋白，并对其理化性质进行表征和对比分析，以期为珍珠贝高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲜活马氏珠母贝，采样来源于广东省湛江市雷州流沙湾养殖场，低温保活转运至实验室，开壳，取其外套膜组织于-80 ℃下冷冻备用。

1.2 试剂与仪器

胃蛋白酶（猪胃黏膜）（高纯，10 000 U•g-1），上海源叶生物科技有限公司；-羟脯氨酸标准品、对二甲氨基苯甲醛、冰乙酸、氯胺T、溴化钾、氯化钠等试剂均为国产分析纯，西陇科学股份有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE配制试剂盒、BCA试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE电泳液、R-250考马斯亮蓝、BeyoColorTM彩色预染蛋白分子质量标准（6.5 ～ 270 ku），碧云天生物技术。

835-50氨基酸自动分析仪，日本日立公司； Spectrum 100傅里叶变换红外光谱仪，Bruker公司；Pyris1 DSC-7全自动热分析仪，美国 TA 沃特斯；DYY-8C电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胶原蛋白的提取

1.3.1.1 酸-酶法提取胶原蛋白 取解冻后的外套膜，用浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液进行酸处理。料液质量（g）体积（mL）比为1∶20，并添加外套膜质量分数2%的猪胃蛋白酶[14]，磁力搅拌24 h，在8 000 r/min下离心取上清，缓慢加入氯化钠并持续搅拌至氯化钠终浓度为0.9 mol/L，静置12 h（胶原蛋白盐析），在8 000 r/min下离心15 min，取出沉淀，缓慢加入0.1 mol/L的乙酸溶液并持续搅拌直至沉淀完全溶解。透析12 h，每4 h换一次透析液，至透析液中性，得胶原蛋白提取液（上述操作均在４℃进行）[15]。将透析液冷冻干燥得到酸-酶溶性胶原蛋白[9]（acid-pepsin soluble collagen，A-PSC(Pm)）。

1.3.1.2 热水浸提法提取胶原蛋白 按质量（g）体积（mL）比1∶40的料液比加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液，去除杂蛋白，以质量（g）体积（mL）比1∶20的料液比加入相应体积的蒸馏水置于95 ℃恒温水浴磁力搅拌4 h，过滤，取滤液冷冻干燥得到胶原蛋白（hot water soluble collagen，HSC(Pm)）[16]。

1.3.2 胶原蛋白提取率的测定 参照GB/T 9695.23-2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》。胶原蛋白提取率（%）的计算如下式：

胶原蛋白提取率 = 羟脯氨酸×11.1÷冻干粉质量。

1.3.3 胶原蛋白理化性质的测定

1.3.3.1 氨基酸组成测定 参照GB5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》。

1.3.3.2 紫外全波长扫描分析 以0.1 mol/L乙酸溶液作空白对照，取适量样品溶于0.1 mol/L 乙酸溶液中，配制成0.1 mg/mL的胶原蛋白溶液。在190 ～ 400 nm处以2 nm/s的速度对两种胶原蛋白溶液进行扫描[17]。

1.3.3.3 傅里叶变换红外光谱分析 参照杨慧等[18]的方法并略作修改。溴化钾使用前于120 ℃烘箱烘4 h以上，烘干后加入适量样品于玛瑙钵体中进行研磨，压片。使用红外光谱扫描测定4 000 ～ 400 cm-1样品透过率，分辨率为4 cm-1。

1.3.3.4 扫描电子显微镜观察 取适量样品固定在导电胶上，喷金时间400 s，加速电压10.00 kV，真空喷金处理后，采用60、100、200、500放大倍数的扫描电子显微镜观察两种胶原蛋白的微观结构。

1.3.3.5 热变性温度测定 取适量样品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，准确移取8 μL样品溶液于铝坩埚后密封，采用空的铝坩埚作空白对照。扫描温度范围为30 ～ 100 ℃，升温速率为3 ℃/min，样品室氮气流量20 mL/min[19]。

1.4 数据统计分析

实验进行三个重复，结果使用Microsoft Excel 2010软件数据分析，数据均以平均值±标准差表示，使用Origin软件进行数据绘图。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白提取率

不同提取方法得到的珍珠贝外套膜胶原蛋白提取率，分别为HSC(Pm)提取率约为42%，A-PSC(Pm)提取率约为22%。其中HSC(Pm)提取率显著高于A-PSC(Pm)提取率（> 0.05）。这一结果相较其他研究仍较低[20]。HSC(Pm)经过碱处理，使胶原内部的纤维暴露，在高温作用下，胶原的三股螺旋结构被破坏，从而分解成大分子胶原蛋白变性产物明胶[21]；A-PSC(Pm)通过酶处理，裂解端肽结构，提高胶原蛋白在酸条件下的溶解度，从而可以提高胶原蛋白的提取率[22]。

2.2 胶原蛋白的氨基酸组成

表1为两种提取方法所得的珍珠贝外套膜胶原蛋白的氨基酸组成，两者均具有胶原蛋白的特征性氨基酸，即甘氨酸、亚氨酸（脯氨酸、羟脯氨酸），说明两种不同提取方法对所得胶原蛋白氨基酸组成并无显著影响。两种胶原蛋白中，蛋氨酸、组氨酸、苏氨酸含量相对较低，而胱氨酸含量均未检出。

氨基酸的组成比例决定了蛋白质的结构、性质和品质[23]。HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的氨基酸相对含量差异较大，表明不同提取方法对胶原蛋白结构的影响程度不同。A-PSC(Pm)由于酶解失去端肽链，肽链共价交联被切断，导致其脯氨酸含量低于其他胶原蛋白[24]。因所处环境温度较低，一般认为水产源胶原蛋白的亚氨酸含量较哺乳动物源的胶原蛋白低[25]。同时，酶解能够有效降解酸提物中的杂蛋白，从而导致HSC(Pm)和A-PSC(Pm)间氨基酸相对含量的差异，其中A-PSC(Pm)亚氨酸含量低于HSC(Pm)。HSC(Pm)甘氨酸质量分数约为20%，A-PSC(Pm)甘氨酸含量较低，占比约为10%，低于一般哺乳动物胶原蛋白中甘氨酸的含量[26]，远低于红唇鱼和黄花鱼（and）鳞片[27]、罗非鱼（）皮[28]、与虾夷扇贝（）[29]中含量相似，推测不同来源的动物物种对胶原氨基酸组成含量有一定的影响。此外还发现，两种胶原蛋白都含有较多的酸性氨基酸（Glu和Asp），同Xia等[30]、马婷等[10]研究结果相似，推测所得两种胶原蛋白均为类V型胶原蛋白。谷氨酸在促进红细胞形成方面具有一定的影响作用，Glu和Asp因在自由基链式反应中能够清除过量的自由基因而具有一定的抗氧化作用[31]。

表1 不同方法提取的胶原蛋白氨基酸组成

注：“-”表示未检出；“0.00”是其含量低于检出限；“#”表示呈味氨基酸；“*”表示必需氨基酸；“&”表示亚氨基酸。1) 表示以100 g原料为基，2）表示以所有氨基酸为基。

Note: “-” means no detected; “0.00” indicated that the contents were below the detection limit; “#” represents flavor amino acid; “*” denotes essential amino acid; “&” stands for sub-amino acid. 1) represents based on 100 g raw materials; 2）denotes based on all amino acids.

2.3 胶原蛋白的紫外扫描光谱分析

通过紫外扫描光谱结果发现，HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的特征吸收峰相差不明显，均在220 nm附近有最大特征吸收（图1），这与胶原蛋白中富含的羟脯氨酸和脯氨酸有关，由-C==O基团中n→π*跃迁导致[16]，证明外套膜胶原蛋白的三级螺旋结构未被破坏。这一结果与海蜇（）[32]、太平洋鳕（Tilesius）鱼皮[33]、尼罗罗非鱼（）皮[34]相似。此外，两种胶原蛋白中均含有少量的芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）（表1），其R基团含有的苯环共轭双键系统使其在280 nm处出现弱吸收峰。

图1 马氏珠母贝外套膜胶原蛋白紫外吸收光谱

2.4 胶原蛋白的红外吸收光谱分析

两种不同提取方法得到的外套膜胶原蛋白红外吸收光谱如图2所示，两种胶原蛋白均具有胶原蛋白红外光谱的特征吸收峰，包括酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带，这与马面鲀（）鱼皮[35]、养殖花鳗鲡（）鱼皮[36]、鲽（）鱼皮[15]研究较为一致。

从表2两种胶原蛋白的主要吸收峰的位置及特征基团可以看出，HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的酰胺A带的最大吸收峰分别是3 320 cm-1和3 296 cm-1。酰胺A带产生的吸收峰通常在3 400 ～ 3 440 cm-1，但当N—H参与氢键的形成时，其伸缩振动便会向低频率移动[37]，证明A-PSC(Pm)形成了较多氢键。由于蛋白质分子的亚甲基基团发生不对称伸缩振动，两种胶原的酰胺B带均在2 930 cm-1附近[38]。HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的酰胺Ⅰ带在1 653 cm-1附近，这主要由于‒C==O基团的伸缩振动。HSC(Pm) 和A-PSC(Pm)的酰胺III带均出现在1 241 cm-1，酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅲ带的存在可以说明，胶原蛋白的三螺旋结构均保持完整[39]。

2.5 胶原蛋白的表面形貌结构分析

将A-PSC(Pm)和HSC(Pm)分别在放大60、100、200和500倍的扫描电镜下进行观察，结果显示，两种胶原蛋白的微观均存在显著差异，但都保留较为完整的纤维结构（图3）。

图2 外套膜胶原蛋白红外光谱

表2 马氏朱母贝外套膜胶原蛋白的红外光谱特征峰值及位置特征基团

(A) A-PSC(Pm)；(B) HSC(Pm)

A-PSC(Pm)呈现出不规则褶皱堆积且呈现致密网状结构，胶原蛋白的薄片部分断裂，说明在胃蛋白酶的作用下，胶原结构发生改变，胶原蛋白间的杂质蛋白被水解，交联片段明显被切碎[40]，结合其疏松多孔的特性，后续可通过测量其孔径大小、物质空隙率等来探究A-PSC(Pm)在保湿及胶原蛋白海绵方面的应用[41]。

HSC(Pm)基本形成薄片状结构，说明热水处理能够破坏胶原的三股螺旋结构使其变性，同时还存在分子间与分子内的交联，使得HSC(Pm)纤维结构更加稳定有序，热稳定性显著提高，推测其具有较优的成膜性能，后续可进一步研究其热变性温度的偏移程度来判断胶原蛋白的交联程度[42]。

2.6 胶原蛋白的热变性温度分析

由图4可知，A-PSC(Pm)和HSC(Pm)的热变性温度分别为91 ℃和93 ℃，两种胶原蛋白的热变性温度差异不大，高于如鲢（）鱼皮热水提胶原蛋白[43]（43.8 ℃）、鲷（）酸溶性胶原蛋白[44]（82.1 ℃）等其他水产源胶原蛋白。

蛋白质的热变性温度与亚氨基酸的含量有关，亚氨基酸中的羧基通过形成氢键来维持蛋白的三螺旋结构稳定，亚氨基酸含量尤其是羟脯氨酸的含量越高，胶原蛋白的热变性温度也越高[45]。结合表1氨基酸组成结果中HSC(Pm)的羟脯氨酸含量较高，所以HSC(Pm)热变性温度高于A-PSC(Pm)。

图4 外套膜胶原蛋白的热变性温度

3 结论

酸-酶法及热水法从马氏珠母贝外套膜提取的胶原蛋白均具有类V型胶原蛋白特性，胃蛋白酶处理未破坏胶原蛋白的三股螺旋结构。HSC(Pm)热稳定性较高；A-PSC(Pm)具有疏松多孔的特性，其必需氨基酸占氨基酸总量的比例较HSC(Pm)高，提示A-PSC(Pm)营养价值较高。综上，两种方法提取的胶原蛋白结构特征及其理化性质均有较大差异，可在实际生产中根据需求选择特定的提取方法用以开发不同类型的产品。

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Characterization of Collagens from Mantle ofby Different Extraction Methods

LIN Hai-sheng1,2,3, WANG Wen1, QIN Xiao-ming1,2,3, CAO Wen-hong1,2,3, ZHANG Chao-hua1,2,3, GAO Jia-long1,2,3, ZHENG Hui-na1,2,3, CHEN Yi-bin4, WU Bin1,2,3

（1.,,524088,; 2.////()//,524088,; 3.,116034,;4.,,571925,）

【Objective】Collagen were extracted from the mantle ofby different methods and their physical and chemical properties were analyzed, with aims to provide theoretical basis for the subsequent development of collagen products.【Methods】Collagens were extracted by acid-pepsic extraction and hot-water extraction, named acid-pepsin soluble collagen (A-PSC(Pm)) and hot water soluble collagen (HSC(Pm)). The amino acid composition, microstructure, secondary structure and thermal denature-temperature of both collagens were comparatively analyzed.【Results】The collagen extraction rate by hot water method was higher than that by acid-pepsic method. The contents of Gly, Glu and Arg in HSC(Pm) were the highest, which were 20.16%, 17.57% and 10.07%, respectively. The contents of Glu, Asp and Arg were about 19.67%, 11.63% and 10.07% respectively in A-PSC(Pm). UV and IR spectrums showed that HSC(Pm) and A-PSC(Pm) had strong absorption peak at 220 nm, and had typical characteristic bands of collagen (amide A, B, Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ). The results of scanning electron microscopy(SEM) showed that A-PSC(Pm) was presented as dense porous network structure, while HSC(Pm) was basically in laminar. DSC analysis results show that HSC(Pm) has better thermal stability.【Conclusion】These results indicated that both HSC(Pm) and A-PSC(Pm) had V-like collagen properties, and there were differences in both structural characteristics and physicochemical properties. In conclusion, different collagen products could be developed according to pearl oyster collagen extraction methods.

; mantle; collagen; physicochemical properties; extraction method

TS 254.9

A

1673-9159（2022）01-0106-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.014

林海生，王雯，秦小明，等. 不同方法提取马氏珠母贝外套膜胶原蛋白理化性质比较[J]. 广东海洋大学学报，2022，42（1）：106-112.

2021-10-23

广东海洋大学博士启动项目（R17082）；2021年度省科技专项资金（“大专项+任务清单”）项目（2021A201-11）；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助（CARS-49）；广东省现代农业产业技术体系创新团队项目（2021 KJ146）；广东海洋大学贝类高值化加工利用创新团队（CXTD2021004）；广东海洋大学创新强校专项项目（Q18292）；湛江市科技计划项目（2014C01019）

林海生（1985―），男，博士，讲师，研究方向为水产品精深加工。E-mail:haishenglin@163.com

伍彬（1984―），男，硕士，高级实验师，研究方向为水产品精深加工。E-mail: wubin23air@126.com

（责任编辑：刘朏）