复方中草药对虹鳟免疫保护力的影响

刘海芳，王 凡，张思琪，李聪歌，马雅雯

复方中草药对虹鳟免疫保护力的影响

刘海芳1，王 凡2，张思琪2，李聪歌2，马雅雯2

（1. 中原工学院，河南 郑州 450007；2. 洛阳师范学院，河南 洛阳 471934）

【目的】研究复方中草药对虹鳟（）肝脏免疫功能及肠道免疫相关基因的影响。【方法】将红枣提取物、山药提取物和黄芪提取物按照质量比1∶1∶1混合，分别按质量分数0（对照）、0.3%、0.6%和1.2%添加到虹鳟基础饲料中，饲喂体长7.6 ～ 8.9 cm 的虹鳟幼鱼56 d。用副溶血弧菌（s）对幼鱼进行攻毒试验(5.48×106cfu/尾)，4 d后，取其肝脏和肠道，测定肝脏的生理生化指标，用半定量PCR及荧光定量PCR测定肠道免疫相关基因的表达。【结果】与对照组比较，肝脏的总抗氧化能力（T-AOC）显著升高（< 0.05），溶菌酶（LZM）水平极显著升高（< 0.01），酸性磷酸酶（ACP）、过氧化氢酶（CAT）活性显著降低（< 0.05），碱性磷酸酶（ALP）活性极显著降低（< 0.01），0.6%剂量组的丙二醛（MDA）极显著降低（< 0.01），而SOD无显著差异（> 0.05）；各复方中草药组肠道的肿瘤坏死因子（TNF-α）及1.2%剂量组转化生长因子-β（TGF-β）转录水平极显著降低（< 0.01），0.3%和0.6%剂量组的补体3（C3）转录水平显著升高（< 0.05）。【结论】复方中草药(红枣+山药+黄芪) 可提高感染副溶血弧菌的虹鳟非特异性免疫功能。

虹鳟；免疫；中草药；副溶血弧菌；肝脏；肠道；非特异性免疫

虹鳟（）是一种适应性较广的冷水性鱼类，其肉质鲜美，刺少肉多，无腥无鳞，高蛋白低脂肪，胆固醇含量极少，富含氨基酸、不饱和脂肪酸，有“水中人参”之称[1]。现阶段虹鳟养殖较为广泛，随着养殖规模的不断扩大和集约化水平的不断提高，虹鳟疾病频发[2-3]。目前，常用化学治疗剂或抗生素药物治疗虹鳟病害，但存在成本较高、使鱼体质减弱、污染养殖水体和周围环境等诸多缺点，不仅降低了成品价值，影响养殖效益，还威胁人们健康。在养殖过程中，如何提升虹鳟自身免疫力，预防鱼病是其健康养殖的关键。

中草药饲料添加剂有天然、无害、低成本、作用广泛及对养殖动物、环境几无副作用等优点[4-5]。目前，已有复方中草药中功能性成分作用的体外评价和体内实验的报道，对其功能性作用机制研究也逐渐深入，表明中草药可促进水产动物生长，提高其抗病及免疫力[6-12]。

红枣（）、山药（L.）和黄芪（Schischkin）是我国常见的药食兼用中药材。红枣中的多糖、维生素、矿物质、皂苷和黄酮类等有丰富的生物学功能[13]。山药的功能性活性成分包括多糖、皂苷、胆甾醇、麦角甾醇、胆碱等，有抗氧化作用[14]。黄芪多糖可促进动物脾内浆细胞增生以及抗体合成，在体液免疫中起促进作用[15]。本课题组前期研究表明，饲喂该3种中草药复合物8周后，虹鳟生长性能有增加趋势，免疫力增强[16]。为研究该复方中草药对虹鳟免疫保护力的影响，本研究在前期研究的基础上，对虹鳟进行副溶血弧菌（）攻毒实验，分析虹鳟非特异性免疫功能相关指标的变化情况，为虹鳟中草药饲料添加剂的适宜添加量研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

红枣、山药和黄芪提取物，为水提物，购自陕西森弗天然制品有限公司，为原料经精选、粉碎、精细提取、过滤、浓缩、精制纯化、干燥、精微粉碎后制成，每1 000 g原材料的提取物为50 g。

实验用虹鳟购自四川省眉山市东坡区天贵水产养殖场，体长7.6 ～ 8.9 cm，于饲养缸（直径×高= 1 m×1 m）中暂养14 d，每日定时投喂3次并及时清理缸内残饵和粪便。暂养期间水温11 ～ 15 ℃，pH 6.9 ± 0.2，溶解氧8 mg/L以上。

副溶血弧菌菌种，中国微生物菌种保藏中心。将菌种接种到配方为蛋白胨20 g/L、氯化钠40 g/L、结晶紫0.000 5 g/L，pH = 8.8的液体培养基中，于36℃条件下培养24 h，制备2.74×107cfu/mL的副溶血弧菌原液，备用。

1.2 实验饲料

参考肉食性鱼类饲料配方及虹鳟饲料配方[17]，制备虹鳟基础饲料，配方见文献[16]。将红枣、山药和黄芪提取物按质量比1∶1∶1混合制成复方中草药，分别按质量比0.30%、0.60%、1.20%在虹鳟基础饲料中依次加入复方中草药，制成相应的复合中草药饲料。使用ZL-600颗粒机制得颗粒饲料，风干24 h，装入保鲜袋，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 实验设计

选取暂养的规格相似、状态良好、无病无伤的虹鳟，停饲24 h，放入冷水鱼养殖循环系统中的饲养缸（直径1 m，水深0.8 m），每缸放入30尾，放入前称量体质量。设对照组和处理组，对照组投喂基础饲料，处理组分别投喂含质量分数0.3%、0.6%和1.2%复方中草药的饲料，每个实验组设3个平行组，实验期间的其他条件同暂养期，养殖周期为8周。养殖实验结束后，进行攻毒试验，根据预试验结果，每组随机选取虹鳟10尾，对鱼腹腔注射0.2 mL 2.74×107cfu/mL副溶血弧菌原液，放入新实验缸观察，记录死亡情况，4 d后剖取存活的虹鳟肝脏和肠道，于液氮中速冻，转移至-80℃冰箱中保存，备用。

1.4 肝脏非特异性免疫指标的测定

将肝脏组织样品置于冰上解冻后，取0.4 g加入9倍 [质量 (g) 体积 (mL) 比] 的冰冷生理盐水，在冰浴中研磨60 s左右，制成匀浆，将匀浆液以4 ℃、2 500 r/min条件离心10 min，取上清液，按照南京建成生物工程公司的试剂盒详细步骤测定总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）水平。

1.5 肠道免疫相关基因的检测

1.5.1 引物序列 肿瘤坏死因子（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）、补体3（C3）、LZM靶基因与内参基因的引物序列（表1）来自文献[18-19]。

表1 PCR引物序列

1.5.2 RNA 的提取与反转录 根据总RNA极速抽提试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）的详细步骤，提取虹鳟中肠的RNA，用超微量分光光度计测定RNA浓度及(260 nm)/(280 nm)，同时用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，对质量好、浓度适宜的RNA根据反转录试剂盒（东洋纺生物科技有限公司）的步骤进行反转录反应。

1.5.3 半定量PCR 根据普通PCR反应步骤，把反转录获得的cDNA和试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）中的上下游引物、2×Tap MasterMix和Nuclear-Free Water配制成25 µL的PCR反应体系，进行PCR扩增反应。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，调整内参基因在每个浓度组条带亮度基本一致，观察目的基因、、和的条带亮度，判断目的基因的表达量。

1.5.4 实时荧光定量PCR 经半定量PCR及实时荧光定量PCR分析，各基因的引物特异性良好。

将反转录反应后的cDNA，各基因的上、下游引物，DBI实时荧光定量试剂盒（DBI ® Bioscience）中的BestarSybr Green qPCR master mix、Nuclear-Free Water制备实时荧光定量PCR反应体系，进行PCR扩增反应。分析反应后的q值，利用2-ΔΔCT法计算非特异性免疫基因的相对表达量。

1.6 数据分析

用SPSS13.0软件中的One-Way ANOVA对实验数据进行方差分析，结果用平均值±标准差表示。用Duncan法对各组间差异进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 复方中草药对虹鳟肝脏免疫保护力相关生化指标的影响

复方中草药饲料对虹鳟肝脏免疫保护力相关生化指标的影响见表2。表2可见，复方中草药组的T-AOC显著高于对照组（< 0.05），LZM极显著高于对照组（< 0.01），0.6%剂量组的T-AOC 显著低于1.2%剂量组（< 0.05），0.3%剂量组的LZM显著高于0.6%和1.2%剂量组（< 0.01）。复方中草药组的CAT、ACP和ALP与对照组相比显著降低（< 0.05），0.3%剂量组CAT显著低于1.2%剂量组（< 0.05），随复方中草药添加剂量增加，ALP活性极显著降低（< 0.01）。0.6%剂量组的MDA极显著低于对照组（< 0.01），0.3%和1.2%剂量组与对照组之间差异不显著（> 0.05）。各组间SOD差异不显著（> 0.05）。

表2 不同中草药添加剂量组虹鳟肝脏非特异性免疫指标

注：同列凡含一个相同字母则表示差异不显著（> 0.05）。

Note: Containing one same letter in the same column indicates no significant difference (> 0.05).

2.2 免疫保护力相关基因的半定量PCR分析

图1显示，与对照组相比，基因在各复方中草药组的表达有升高的趋势；基因在1.2%剂量组明显降低，在0.3%和1.2%组无显著变化；基因的表达调控与基因类似；基因在各复方中草药组无明显变化。

2.3 复方中草药对虹鳟肠道免疫保护力相关基因表达的影响

图2可见，与对照组相比，0.6%和1.2%剂量组基因表达量显著上升（< 0.05），分别依次上调38.8%和30.2%。复方中草药组基因表达量无显著差异（> 0.05）。复方中草药组基因表达量显著下调（< 0.01），分别依次下调44.4%、42.6%、32.3%。1.2%剂量组基因表达量显著下调（< 0.01），下调92.9%。

图1 不同实验组虹鳟肠道的内参及目的基因

凡含一个相同字母则表示差异不显著（P > 0.05）。

3 讨论

3.1 复方中草药对虹鳟肝脏免疫相关生化指标的影响

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡且倾向于氧化的状态。丙二醛（MDA）是氧化应激过程产生的代表性毒性中间产物。总抗氧化能力是指各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是较为重要的两种抗氧化酶。抗氧化物质可清除生物体内多余的自由基来增强免疫力。本研究中，在副溶血弧菌刺激下，复方中草药组虹鳟肝脏的T-AOC显著提高，0.6%剂量组MDA显著降低，表明复方中草药提高了虹鳟肝脏的抗氧化能力，尤其在0.6%浓度组表现得更为突出。王得清等[20]指出，黄芪总黄酮具有清除自由基的作用，刘飞等[21]研究表明，红枣提取物显著提高虹鳟肝脏和肾脏SOD活性，降低肾脏MDA水平，WANG等[22]研究发现，山药提取物提高虹鳟血清SOD活性。本课题组前期研究也表明，该复合中草药在投喂虹鳟56 d后，虹鳟血清SOD显著升高。但本研究发现，副溶血弧菌刺激下，复方中草药组虹鳟肝脏CAT显著降低，而SOD无显著变化，由此推测，虹鳟肝脏在病原菌刺激下，复方中草药组虹鳟构成总抗氧化能力的其他抗氧化类物质可能显著提高，从而抑制了CAT活性[23]，同时复方中草药成分和鱼组织的不同也会导致各种抗氧化酶结果的不同。

ACP和ALP在动物免疫反应中发挥重要作用，也是反映其肝功能的两个重要指标。ACP直接用于磷酸基团的转移，参与能量转化和信号转导，提高机体的非特异性免疫水平和营养代谢水平[8]。ALP在碱性介质中可通过水解作用清除表面带有磷酸酯的异物，其活性的高低与动物的生长性能关系密切[9]。本研究中发现，副溶血弧菌刺激下，复方中草药组肝脏的ACP和ALP显著性降低，表明对照组被病原菌攻击，肝脏的ACP和ALP相对升高，免疫水平和肝脏代谢功能降低，而复方中草药增加了虹鳟肝脏的非特异性免疫功能，保护肝脏。

LZM可溶解细菌细胞壁而使细菌溶解，也可与带负电荷的病毒蛋白结合，与核酸、脱辅基蛋白形成复合体，使病毒失活。因此，其活性与动物的抗病性和免疫密切相关[10]。血清和肝胰脏在识别外来异物和免除异物侵害时发挥重要作用。本研究中，副溶血弧菌刺激下，复方中草药组肝脏的LZM与对照组相比较显著升高，表明复方中草药提高了虹鳟肝脏抑菌能力，可能与复方中草药提高了鱼类的消化能力及营养成分的利用率有关[24]。这也与复方中草药对虹鳟血清LZM影响的结果相一致[16]。

3.2 复方中草药对虹鳟肠道免疫保护力相关基因表达的影响

TNF-α是巨噬细胞受到病原体等有害刺激产生的小分子蛋白，能直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒性，是炎症反应必须的介质[25]。本研究中，弧菌攻毒处理后，复方中草药组基因表达量显著下调，说明其肠道促炎症因子降低，复方中草药增加了虹鳟肠道的免疫水平，降低炎症反应。本课题组前期研究表明，该配方的复方中草药显著提高了虹鳟血清含量[16]，同时还发现该配方中的山药提取物[22]和红枣提取物[21]也显著提高了虹鳟肠道中的mRNA表达量，说明该配方中草药能通过的表达调控来提高虹鳟的免疫功能。

补体系统在先天性免疫中有良好的作用（趋化、调理和消灭病原体），补体的激活可促进B细胞增殖、分化，最终产生抗体和效应淋巴细胞，连接免疫系统[26-28]。C3为补体系统中含量最高的成分。本研究发现，随着饲料中中草药添加量的上升，虹鳟肠道中表达量有上升的趋势，且在0.6%与1.2%组显著上升，表明虹鳟在投喂中草药后肠道获得性免疫提升，有助于虹鳟抵抗外界不良环境，极大地提高虹鳟的抗菌能力。刘飞等[21]研究表明，红枣提取物提高了虹鳟头肾中基因表达量，周显青等[12]指出，黄芪能明显促进中华鳖（）血清补体C3的合成，WANG等[22]研究显示，山药提取物显著提高了虹鳟血清含量，本研究前期研究同样证实该配方中草药提高虹鳟血清中和的含量，这些结果和本研究结果一致，表明该复方中草药的各种成分均可增强鱼类的补体水平，增加抗菌能力。

TGF-β即转化生长因子，主要作用是通过促进细胞外基质的形成与抑制免疫反应等来调节细胞的生长与分化，也是调节B淋巴细胞的重要细胞因子，能抑制其增殖，诱导凋亡，阻断活化与分化[29]。本研究发现，在投喂中草药添加剂后，基因表达量在1.2%剂量组显著下调，说明复方中草药能显著增强虹鳟淋巴细胞分化，进一步证实复方中草药添加剂能显著增强虹鳟的免疫能力。

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Effect of Chinese Herbal Compound on Immune Protection of Rainbow Trout()

LIU Hai-fang1, WANG Fan2, ZHANG Si-qi2, LI Cong-ge2, MA Ya-wen2

（1. Z,450007,;2.,471934,）

【Objective】The aim of this study is to study the effect of Chinese herbal compound (CHC) on liver immune function and intestinal immune-related genes of rainbow trout ().【Method】Juvenilerainbow trout with a body length of 7.6 - 8.9 cm were fed the diets containing CHC prepared by jujube, yam and astragalus extracts (20∶1) in equal proportion at a dose of 0, 0.3%, 0.6% and 1.2% for 56 d, and then were injected withs (5.48×106cfu/ind). Four days after injection, physiological and biochemical indexes in the liver and the expressions of immune related genes in the intestine were detected by semi-quantitative PCR and qPCR.【Results】Compared with the control, T-AOC and LZM activity were significantly increased (< 0.05< 0.01, ), and the acid phosphatase(ACP), catalase (CAT), and alkaline phosphatase (ALP) activities were decreased (< 0.05), and the MDA level in 0.6% group was also decreased (< 0.01); while SOD was not changed (> 0.05); expressions ofgene in theintestine of CHC groups andgene in 1.2% group were significantly decreased (< 0.01), whilein 0.3% and 0.6% groups were increased (< 0.05). 【Conclusion】CHC (jujube+yam+astragalus) can improve the nonspecific immune function level of rainbow trouts infected withs.

; immune; Chinese herbal medicine;; liver; intestine; nonspecific immune

S968

A

1673-9159（2022）01-0007-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.002

刘海芳，王凡，张思琪，等. 复方中草药对虹鳟免疫保护力的影响[J]. 广东海洋大学学报，2022，42（1）：7-12.

2021-07-27

河南省科技厅科技攻关项目（182102110407）

刘海芳（1977―），女，副教授，研究方向为水生生物学。E-mail: 49112015@qq.com

（责任编辑：刘庆颖）