靶向视黄酸（维甲酸）诱导基因蛋白-Ⅰ受体应用的研究进展

李克雷，吴星 综述，郑海发，梁争论 审校

1. 中国食品药品检定研究院肝炎病毒肠道病毒疫苗室，北京 102629；2. 北京民海生物科技有限公司，北京 102629

在天然免疫中，模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），包括 Toll-样受体（Toll-like receptors，TLRs）、C-型凝集素受体（C-type lectin receptors，CLRs）、NOD-样受体（Nod-like receptors，NLRs）和视黄酸（维甲酸）诱导基因蛋白-Ⅰ（retinoic acid inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）样受体（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）等，通过识别病原相关模式分子，诱导干扰素产生和促炎症因子释放［1］。其中，RLRs 是重要的外源核酸传感器，可识别病毒复制过程中产生的双链RNA 发挥抗病毒作用。

目前，靶向TLRs、CLRs 和NLRs 的药物已进入临床研究阶段或已上市，而靶向RLRs 的药物尚还处于研究阶段。RLRs 作为新的药物靶点，其配体显示了良好的应用前景，因此，本文对靶向RLRs 的抗病毒作用及其相关应用研究作一综述，为新型抗病毒和肿瘤药物及疫苗佐剂的研究提供参考。

1 RLRs 结构

RLRs 属于 DExD ／H 盒子 RNA 解旋酶，由 RIG-Ⅰ受体、黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differen-tiation-associated gene 5，MDA5）、生理学实验室蛋白 2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2）组成，其主要功能是识别病毒RNA，激活干扰素信号通路，进而启动抗病毒免疫反应［2-3］。

RLRs 的 3 种受体均包含 1 个 DExD ／ H 盒 RNA解螺旋酶结构域和1 个C-端结构域（C-terminal domain，CTD），其中，RIG-Ⅰ和 MDA5 的 N-端还有半胱天冬酶激活招募结构域（caspase activation and recruitment domain，CARD）。当 RNA 解螺旋酶和CTD识别病毒 RNA 后，RIG-Ⅰ和 MDA5 通过 CARD 与下游蛋白分子线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondria anti-viral signaling protein，MAVS）相互作用传导信号［4］。RLRs 的结构示意图见图 1［5］。

图1 RLRs 的结构示意图Fig. 1 Structure of RLRs

2 RLRs 活化和信号传导

研究显示，多种病毒可激活RLRs，如登革病毒（Dengue virus）、肠道病毒 EV71 型（enterovirus 71）和寨卡病毒（Zika virus）等［6-8］。在病毒感染过程中，RIG-Ⅰ可识别病毒复制过程中产生的5′端三磷酸化的富含 polyU ／UC 的短链 dsRNA（5′ppp-dsRNA）［9-11］。一般情况下，RIG-Ⅰ的CARD 处于自我抑制状态，当5′ppp-dsRNA 被 RIG-Ⅰ的 CTD 识别，RIG-Ⅰ构象发生变化，CTD 中的盖环结构与带负电荷的5′端的三磷酸结合，形成螺旋酶结构域 ／ CTD 与dsRNA的复合物，CARD 由抑制状态释放，与MAVS 相互作用［12］。与 RIG-Ⅰ不同，MAD5 结合长的 dsRNA（＞2 000 bp），主要识别小RNA 病毒的感染，如脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒等［13］。由于RIG-Ⅰ与MAD5识别核酸序列机制的差异，麻疹病毒和VSV 等可同时活化这两种受体［14-15］。尽管LGP2 与dsRNA 也具有较强的结合活性，但其主要作用是调节RIG-Ⅰ和MAD5 活性［16-17］。

RLRs 介导的抗病毒信号通过 MAVS 蛋白传导［18］。MVAS 蛋白通过自身的CARD 与RIG-Ⅰ或MAD5的CARD 相互作用后发生活化，活化的MVAS 招募肿瘤坏死因子相关受体3（tumor necrosis factor receptoras ociated factor 3，TRAF3）和丝氨酸蛋白激酶（IKKε／TBK1）复合物，IKKε ／ TBK1 复合物随后诱导干扰素调节因子 3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和干扰素调节因子 7（interferon regulatory factor 7，IRF7）活化，进而IRF3 和IRF7 调控转录调节因子NF-κB诱导Ⅰ型和Ⅲ型干扰素产生。最终，干扰素通过Ⅰ型干扰素受体激活JAK-STAT 途径诱导产生大量干扰素刺激基因（interferon stimulated gene，ISGs）和促炎症细胞因子，引发抗病毒反应［19-20］。

3 靶向RLRs 的应用研究

RLRs 是抗病毒免疫反应的重要部分，因此成为抗病毒治疗的靶点；RLRs 活化后可激活内源和外源凋亡途径诱导癌细胞凋亡，因而其配体可在癌症治疗中发挥作用。RLRs 活化产生的细胞因子可活化CD4+和CD8+，因此，RIG-Ⅰ配体可作为新型疫苗佐剂，提高疫苗的免疫效果。

3. 1 抗病毒药物 当前靶向RIG-Ⅰ的抗病毒药物主要有3 类：一类是化学合成的二核苷酸衍生的小分子化合物，以SB9200 为代表；另一类是病毒来源的 5′ppp-dsRNA，以 VSV 来源的 M8 为代表；还有一类是小分子化合物，以异黄酮类化合物为代表。

SB9200 主要治疗慢性乙肝患者，具有直接抗病毒作用，也可激活宿主的抗病毒应答。SB9200 通过与RIG-Ⅰ和NOD2 结合激活RIG-Ⅰ，并增强RIG-Ⅰ与 HBV 前基因组 RNA（pgRNA）的 5′-区域的结合，置换乙肝病毒聚合酶蛋白（HBV-Pol）或阻止pgRNA衣壳化和复制复合物的组装，从而抑制HBV 的复制过程［21］。SB9200 临床结果显示，在单药 12 周给药周内，HBV DNA 和RNA 的抑制呈显著的剂量依赖性关系。在低剂量组SB9200 单药治疗12 周结束时，8名患者出现了强烈的抗病毒反应，HBV DNA水平至少减少了1 log10，HBV RNA 水平至少减少了3 log10［22］。但该药物在Ⅱ期临床实验中造成了3 名患者的严重副反应［23］，因此，仍需进一步深入研究RLRs 的抗病毒作用机制。

病毒感染过程中产生的5′ppp-dsRNA 是RIG-Ⅰ的特异性配体。因此，通过体外转录方法获得的病毒来源的5′ppp-dsRNA 可特异性活化RIG-Ⅰ。细胞水平实验证实，分别来源于水泡性口炎病毒和柯萨奇病毒B 组3 型的5′ppp-dsRNA 可有效抑制水泡性口炎病毒、VSV 在肺上皮细胞A549 细胞中的复制；体内实验结果显示，5′ppp-dsRNA 可保护小鼠免受H1N1 流感病毒的致死剂量攻击，减少小鼠肺内的病毒滴度；与未治疗组相比，25 μg 的 5′ppp-dsRNA在24 ～48 h 可显著抑制病毒在肺部的复制，72 h后治疗组的病毒滴度降低了10 倍［24-25］。且5′pppdsRNA 的序列、长度和结构对诱导RIG-Ⅰ的抗病毒活性有一定影响。基于水泡性口炎病毒的基因组序列设计的5′ppp-dsRNA，经修饰后获得了长99 bp、富含尿苷的发夹结构序列（M8），该序列通过特异性激活RIG-Ⅰ，诱导产生的IFNβ 的表达量为polyI ∶C的2 倍，表明M8 可诱导更强的干扰素反应；动物实验表明，经5 μg M8 治疗后，流感病毒感染动物的生存率提升至 80%［26］。BEDARD 等［27］和 PATTABHI等［28］采用高通量筛选的方法筛选出的靶向RIG-Ⅰ的小分子化合物为异黄酮类化合物，主要有KIN101、KIN1408 等。这些小分子化合物通过MVAS-IRF3的途径诱导干扰素产生，可有效抑制丙型肝炎病毒、流感病毒以及登革病毒的感染［29-30］。

3. 2 抗肿瘤药物 固有免疫的核酸识别和传感机制是引起适应性免疫的重要介质，cGAS、STING 和RIG-Ⅰ激动剂已被证实是癌症治疗中的免疫肿瘤药物［31］。其中，RIG-Ⅰ可通过多种方式诱导肿瘤细胞凋亡［32］。

在黑色素瘤的治疗研究中，将5′端三磷酸化的siRNA 作为RIG-Ⅰ激动剂，一方面沉默抗凋亡基因Bcl2 的表达，另一方面诱导干扰素表达和NK 细胞活化诱导细胞凋亡［33］；在RIG-Ⅰ配体治疗胰腺癌的小鼠模型中，RIG-Ⅰ配体通过活化DC 和CD8+T 细胞后，肿瘤体积缩小了近2 倍［34］，该过程中钙网蛋白转移至细胞膜外，CXCL10 分泌增加，胰腺癌细胞表面CD95 和MHC-I 的表达上调，增强了CD95L 和细胞毒性T 细胞介导的凋亡作用，采用纳米颗粒递送系统后，可进一步促进肿瘤微环境中的促炎症因子释放，使CD8+T 细胞的比例增加2 倍［35］。另外，RIG-Ⅰ活化引起的细胞凋亡还可通过MAVS 诱导促凋亡蛋白Noxa 的表达发挥作用［36］。前文提到的RIG-Ⅰ激动剂M8 可诱导多种瘤细胞上的抗原表达，并引起DC 活化，从而引发细胞凋亡［37］。在协同免疫检查点抑制剂方面，5′ppp-RNA 通过RIG-Ⅰ诱导细胞毒性T 细胞的交叉启动及抗肿瘤免疫依赖于宿主转接器蛋白MAVS 和Ⅰ型干扰素（IFNⅠ）信号，协同CTLA-4 抗体阻断诱导抗原特异性CD8+T 细胞的扩增和活化增强抗肿瘤免疫［38-39］。这些研究说明，RIG-Ⅰ在肿瘤免疫治疗中具有较大潜力的应用前景。

3. 3 佐剂 很多靶向PRRs 的激动剂均可作为疫苗佐剂。目前，进入临床阶段的佐剂有 CpG、poly（I ∶C）等，已上市的佐剂有 AS01、AS04、MF59 等［40］。RLRs作为识别病毒RNA 的PRRs，活化后即可诱导抗病毒作用的固有免疫反应，也可调节适应性免疫应答［41］，其配体也具有作为佐剂的应用前景。

KIN148 可通过RIG-Ⅰ诱导IRF3 活化的小分子化合物，PROBST 等［42］将其与 H1N1 流感病毒制成裂解疫苗后免疫小鼠，研究KIN148 的佐剂活性。结果显示，加入KIN148 的疫苗可保护小鼠免受致死剂量病毒的攻击，在小鼠肺和肺淋巴结中的T 细胞可分泌大量IL-10，引起TH2 细胞应答，小鼠的存活率提升至80%。

HOCHHEISER 等［43］比较了佐剂 CpG ODN1668、poly（I ∶C）和 5′ppp-RNA 引起细胞毒性 T 细胞反应的差异。研究发现，5′ppp-RNA 可通过Ⅰ型干扰素信号途径诱导特异性细胞毒性T 细胞反应，且5′ppp-RNA 比 CpG 抑制病毒感染效果更强。LUKE 等［44］构建了共表达 5′ppp-RNA 和 CpG 的流感 DNA 疫苗，该疫苗进入细胞后，可在RNA 聚合酶Ⅲ的作用下表达5′ppp-RNA，进而活化RIG-Ⅰ，从而促进疫苗抗原诱导抗HA 的中和抗体水平和免疫细胞活化程度。MARTÍNEZ-GIL L 等［45］对来源于 VSV 的短链5′ppp-RNA（M8）的佐剂活性进行了评价，将M8与流感病毒的VLP 配伍后免疫动物。结果显示，M8与VLP 联合应用可提高流感病毒感染小鼠的存活率，且其诱导产生的HAI IgG 抗体滴度分别为铝佐剂、addavax 和 poly（I ∶C）佐剂的 2 倍，且 M8 免疫小鼠后可产生长期的免疫反应；在调节适应性免疫方面，M8 主要活化 TH1 细胞，铝佐剂和addavax 活化TH2 细胞，M8 诱导的细胞因子 IFNγ、IL-2 和 TNF-α表达水平更高；体外合成的dsRNA（仙台病毒来源）与灭活的H1NI 流感病毒经鼻腔或肌肉联合免疫后，诱导产生的血凝素特异性IgG 的滴度 > 1 000，为对照组的10 倍，可保护小鼠免受甲型流感病毒致死量攻击［46］。

4 展 望

新发突发病毒性传染病严重威胁公众健康，迫切需要有效药物和疫苗。RIG-Ⅰ激动剂作为新的抗病毒药物，可作为疫苗佐剂与疫苗抗原联合使用，可提高新型疫苗的有效性。但RIG-Ⅰ激动剂作为抗病毒药物和疫苗佐剂在机理、制备平台、递送方式、安全性和有效性等方面尚存在问题，因此，加强RLRs 相关研究将促进抗病毒药物、肿瘤治疗药物和疫苗佐剂的研发。