肽基精氨酸脱亚胺酶在脑梗死患者中的表达及意义

童洋萍 黄超平 王 振 唐建生 徐 伟 李芳毅 胡 珏

南华大学附属长沙中心医院，湖南 长沙 410004

卒中是全球第二大死亡原因，也是致残的主要原因，在发展中国家发病率越来越高［1］，给经济及社会发展带来沉重负担。研究表明，87%的卒中是缺血性卒中［2-3］，缺血性脑卒中发病过程中伴随多个基因表达的改变，这些基因表达的上调或下调对疾病的发生、发展和转归起重要作用［4-5］，因而从分子水平揭示缺血性脑卒中的发病机制成为治疗该病的研究重点［6］。而目前临床尚未有分子标志物或基因可以准确反映脑卒中的发病机制或预测疾病的预后结局，因此，发现某一基因或分子标志物能够反映脑卒中的具体进展过程，成为亟需解决的课题。研究发现PADI4 基因与缺血性脑卒中的发病密切相关，但尚未检索到PADI4 在脑卒中作用的报道。肽基精氨酸脱亚胺酶（peptidyl arginine deiminase，PAD 或PADI）是一类介导修饰翻译后蛋白质瓜氨酸化的钙依赖性半胱氨酸水解酶家族［7-8］，包含5种同工酶，表达于特异性组织和作用于不同的靶蛋白，与炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和基因调控有关。肽酰精氨酸脱亚胺酶-4（PADI4）是其中的一员，主要表达于造血组织，如外周血的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞［9-10］，在中性粒细胞和巨噬细胞介导的炎症和免疫反应中发挥作用［11］，参与了感染性疾病、自身免疫性疾病和缺血性疾病等发病过程［12-14］。多项研究报道抑制PADI4可以保护某些器官免受缺血性损伤。DU等［15］研究发现特异性抑制PADI4 可能是减轻肾缺血-再灌注损伤并发远端肺损伤的有效策略；LANGE 等［8］研究发现药理抑制PADI4 能显著减轻新生儿缺氧缺血性脑损伤。尽管目前有关PADI4 在缺血性疾病中的研究逐渐增加，但绝大多数局限在动物研究模型，且部分动物研究结果关于PADI4 在缺血性疾病中的作用存在冲突。DU 等［13］研究发现，特异抑制PADI4 可减少急性心肌梗死诱导的中性粒细胞浸润、中性粒细胞细胞外陷阱（neutrophil extracellular，NETs）、炎症反应和心肌细胞凋亡。而EGHBALZADEH 等［16］研究表明PADI4缺乏加重心肌梗死后急性炎症，增加组织损伤。因此，本研究从临床上研究脑梗死患者和非脑梗死患者PADI4 的变化情况，希望从分子水平方面为脑梗死的治疗提供可供参考的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020-03—10 南华大学附属长沙市中心医院神经内科收治住院的40例急性脑梗死患者，男30例，女10例，年龄64（56～69）岁；均符合《2018 中国急性缺血性卒中诊治指南》制定的脑梗死标准。纳入标准：（1）年龄30～80 岁，发病24 h 内入院；（2）TOAST 分型为大动脉粥样硬化型或小血管闭塞型患者；（3）3 个月后电话随访无失联。排除标准：（1）存在其他神经系统合并疾病，如颅脑外伤或脑肿瘤者；（2）感染或有严重肝、肾功能障碍者；（3）存在恶性肿瘤、风湿免疫性疾病、冠心病或周围血管闭塞性疾病患者。对照组为40例同期收治住院的与病例组年龄相匹配的非脑梗死患者，同样按照上述剔除标准筛选，其中男17 例，女23 例，年龄57（50～65）岁。该项检测经院伦理委员会认可，均签署知情同意书。

1.2 实验材料与方法

1.2.1 临床资料：记录病例组及对照组的临床基线资料、病例组影像学检查（梗死部位、颅内外血管情况确定TOAST分型）、实验室检查指标（血脂、血同型半胱氨酸、白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数等）以及病例组NIHSS评分、90 d mRS评分（将mRS评分0～1分定义为预后良好，mRS评分≥2分定义为预后不良）。

1.2.2 实验方法：入院当天抽取外周静脉血2 mL，用红细胞裂解法提取白细胞（北京索莱宝科技有限公司），提取白细胞内的总RNA 并逆转录成cDNA（北京全式金生物公司），再用RT-qPCR 技术检测PADI4 的相对表达量（Real-Time PCR System 为美国ABI 公司）。PADI4 和内参GAPDH 的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。具体序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Primers for Real-Time quantitative PCR

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料符合正态分布的以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的采用中位数和四分位数间距描述，2组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料采用卡方检验，必要时使用Fisher 确切概率法；多因素分析采用二元Logistic回归分析；P＜0.05为差异有统计学意义。诊断试验效能的评价采用ROC 曲线分析。

2 结果

2.1 2 组临床资料比较病例组与对照组性别、高血压、血同型半胱氨酸、白细胞计数、中性粒细胞计数比较差异有统计学意义（P＜0.05）。2 组年龄、吸烟史、饮酒史、糖尿病、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、单核细胞计数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 病例组与对照组基线资料比较Table 2 Comparison of baseline data of case group and control group

2.2 PADI4 相对表达量在2 组中的表达情况及与脑梗死预后的关系

2.2.1 PADI4 在2 组的表达情况：PADI4 在病例组中的相对表达量为1.06（0.91～1.21），对照组为0.86（0.80～0.95）。病例组的相对表达量较对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图1。2.2.2 Logistic 回归分析：采用二元Logistic 回归分析，分别纳入PADI4相对表达量、性别、原发性高血压、血同型半胱氨酸、糖尿病、白细胞计数、中性粒细胞计数等相关指标，结果显示病例组PADI4 相对表达量高于对照组（OR=42.33，95% CI：2.293～778.013，P=0.012），同时血同型半胱氨酸和糖尿病高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；2 组性别、原发性高血压、白细胞计数、中性粒细胞计数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图1 PADI4在病例组和对照组中的相对表达量Figure 1 The relative expression of PADI4 in the stroke group and control group

表3 Logistic回归分析Table 3 Logistic regression analysis

2.2.3 病例组PADI4 相对表达量与预后的关系：PADI4 在预后良好组（mRS 0～1）的相对表达量为1.07（0.97～1.25），预后不良组（mRS≥2）的相对表达量为0.99（0.85～1.10），两者比较差异无统计学意义（P=0.133）。

2.3 PADI4 相对表达量的ROC 曲线分析绘制PADI4 相对表达量的ROC 曲线，进行诊断试验效能的评价，AUC为0.759，PADI4用于诊断脑梗死的敏感度为70.0%，特异度为82.5%，P＜0.001。见图2。

图2 PADI4相对表达量在脑梗死中的诊断价值Figure 2 Diagnostic value relative expression of PADI4 in cerebral infarction

3 讨论

脑梗死是脑卒中的主要类型，具有发病率高、复发率高、致残率高、病死率高等特点［17-18］，病理生理机制复杂，环境及遗传因素均参与其发病过程［19］。尽管目前缺血性脑卒中的病理生理学及其导致缺血性损伤的潜在机制已经取得相当大的进展，但仍存在治疗困难等问题。研究报道PADI4 基因与缺血性脑卒中的发病密切相关，但尚未检索到关于PADI4在脑卒中的作用报道。本研究首次对脑梗死患者血液中的PADI4相对表达量展开研究，以评估其在脑梗死过程中的作用，并尝试分析其分子机制，希望为脑梗死的治疗提供理论依据。

研究显示，PADI4在缺血等各种病理条件下引起的炎症反应和NETs的形成中起关键作用［20-21］。研究显示，PADI4 是不依赖NADPH的NETs所必需的酶，PADI4能将蛋白质、自身抗体和组蛋白H3 和H4 上的精氨酸转化为瓜氨酸化，而组蛋白H3和H4的瓜氨酸化与NET的释放特别相关，能迅速形成NETs［22］，反映了NETs 的出现情况［23］。有证据表明NETs 作用于静脉和动脉血栓的形成，在动脉粥样硬化和血栓形成中起决定性作用［24-27］。NETs通过诱导氧化应激、诱导内皮细胞功能障碍和凋亡以及形成一种纤维蛋白样的碱基使血小板黏附、激活和聚集等促进血栓形成［25］，其提供了炎症、血栓形成、氧化应激和心血管疾病之间先前未知的联系。LIU 等［28］研究发现，PADI4 基因敲除的小鼠患动脉粥样硬化的概率相对更低。LING等［29］研究发现Nets可促进冠状动脉微血栓形成，采用PADI4抑制剂可降低心肌梗死和动脉粥样硬化的发病率。本研究发现PADI4 在病例组中的相对表达量较对照组显著升高，由于脑梗死的发病与高血压、性别、糖尿病等危险因素相关，因此，通过Logistic回归分析发现，PADI4相对表达量与脑梗死的发生独立相关，提示PADI4在脑梗死的发生过程中可能充当危险因子，推测通过抑制PADI4的形成或降低PADI4的水平可以抑制NETs的形成而预防动脉粥样硬化的形成或减少轻动脉粥样硬化的程度，起到脑卒中的一级预防作用。KANG等［30］在脑缺血动物模型中发现，缺血脑组织中存在PADI4的上调，PADI4的过度表达导致中性粒细胞胞外网状陷阱形成增加，伴随着新生血管的减少和血-脑脊液屏障损伤的增加。同样RABADI 等［31］在肾缺血/再灌注损伤动物模型中也发现PADI4 上调的情况。本研究发现PADI4 相对表达量在病例组中明显升高，从侧面验证了临床和动物实验具有一定的一致性，PADI4基因的上调促进了脑梗死的发生。脑梗死后的病理生理机制包括兴奋性氨基酸毒性、钙超载、神经元凋亡、炎症反应等。脑梗死发生后伴随细胞内钙水平增加［32-33］，而PADI4 是一种Ca2+依赖酶，需要提高Ca2+水平来激活［34］，因此推测脑梗死后可能伴随PADI4活性的增强，钙拮抗剂治疗可降低PADI4的活性，从而抑制梗死后炎症反应的程度。

SHIMONAGA 等［23］研究发现，PADI4 反映NETs 的出现情况，在不稳定性颈动脉斑块中有较高的表达。KIM等［35］动物研究发现，脑梗死后PADI4 在脑实质和血中性粒细胞中表达显著增强，诱导组蛋白中的瓜氨酸酸化并释放NETs，加重炎症和脑损伤。VAIBHAV 等［36］研究发现，在创伤性脑损伤患者中，PADI4 介导的NETs会加重急性神经损伤和脑血管功能障碍，靶向治疗可改善患者预后。因此，推测PADI4可能通过NETs的形成参与脑梗死的发展及加重脑损伤，PADI4 抑制剂或抑制NETs的形成可作为临床上治疗脑梗死的一种可选手段。

研究表明炎症-免疫参与了脑梗死的病理生理过程，脑梗死发生后血-脑脊液屏障被破坏，炎症细胞侵入缺血脑组织，进而产生细胞因子和黏附分子，引发炎症级联反应，造成脑组织损伤；免疫介质能促炎症发展，促进缺血影响区域内众多炎症细胞类型，包括各种亚型T细胞、单核细胞-巨噬细胞、中性粒细胞等的渗透，这个过程导致大脑进一步的缺血性损伤［37］。最新一些关于脑梗死后的后期分子机制研究进一步阐述了分子信号通路在脑梗死后发挥重要作用，如IL-6/STAT3 通路的激活以及VEGF-A/MMP-9信号的衰减与尿素影响卒中后的神经炎症和细胞凋亡相关［38］；下调TLR4、p-NF-κB、pro-Caspase-1、Caspase-1 等TLR4/NF-κB/NLRP3 信号通路相关蛋白可增加缺血性脑卒中后新生神经元数量和脑微血管密度［39］。虽然随着炎症分子及信号通路等各方面的研究不断深入，对理解脑梗死后的分子机制越来越深刻，但反映临床病程进展的分子标志物尚未明确证实。WU 等［40］通过一项19 873人的荟萃分析发现，TNF-α的基因多态性和循环水平与缺血性脑卒中有关，可能作为分子标志物。本研究发现PADI4 在脑梗死患者中高表达，推测PADI4可能是研究脑梗死病理机制的一种新的生物学标志物。

关于脑梗死的预后分析显示，PADI4相对表达量在预后良好组与预后不良组中无明显差异。分析产生阴性结局的原因有样本量较小、纳入分析的脑梗死患者初始发病神经功能缺损症状较轻，90 d mRS 差异较小等。以非脑梗死患者为参照绘制ROC 曲线，显示PADI4 相对表达量对脑梗死有较好的诊断效能，可作为脑梗死发病机制的一种新的诊断标志物。

本研究发现PADI4 相对表达量与脑梗死的发生独立相关，对脑梗死的发病有一定的诊断效能，其可能参与了脑梗死的发生及发展。PADI4 可能通过NETs 对脑梗死造成损伤，可作为研究脑梗死病理机制的一种新的生物学标志物。