茶多酚对乳鸽十二指肠形态发育、抗氧化功能和紧密连接蛋白基因mRNA表达的影响

付 晶，邓 珊，陈艾玲，黄燕华,3*

（1.仲恺农业工程学院健康养殖创新研究院，广州 510225；2.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州 510225；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广州 510640）

鸽子属于晚成鸟，但与鸡、鸭、鹅等家禽相比，其生长速度非常快，28日龄体重达到刚出壳时25倍以上。乳鸽快速增长除与亲鸽提供高营养鸽乳有关，还与其特有的消化生理功能，尤其是肠道功能紧密相关[1]。目前我国养鸽业已成为继鸡、鸭、鹅以外第四主流家禽产业。但规模化生产仍面临诸多瓶颈问题，尤其是“饲料禁抗”以来，鸽肠道健康问题日益突出。因此，在畜牧业转型升级、畜禽标准化养殖模式持续推进大形势下，开发功能性饲料添加剂对维持鸽肠道健康具有现实意义[2]。

茶多酚（Tea polyphenols，TP）是一类从茶叶中提取的多羟基酚类物质总称，其主要成分为儿茶素类、花色苷类、黄酮类和酚酸等化合物，具有抗氧化、抑菌和维持肠道健康等功能[3]。茶多酚作为功能性饲料添加剂在畜禽生产中应用广泛[4-6]，但其发挥生物学特性内在机制还有待进一步研究。目前，茶多酚对鸽肠道健康影响的研究未见报道，本试验通过向亲鸽饲粮添加不同剂量茶多酚，旨在观察其对乳鸽十二指肠形态结构、抗氧化功能以及肠道紧密连接相关基因表达量的影响，以期为茶多酚在养鸽生产中的合理应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

试验仔鸽和基础饲粮均由广州市厚德鸽养殖有限公司提供；纯度98.9%茶多酚购自成都华高生物有限公司。

1.2 试验设计与试验饲粮

试验采用单因素随机分组设计。选取初始体重一致、健康1日龄仔鸽240只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复10只仔鸽。对照组饲喂基础饲粮，茶多酚低、中和高剂量组在基础饲粮中分别添加100、200和400 mg·kg-1茶多酚。根据鸽子采食习性并结合养殖生产实际，基础饲粮由70%原粮和30%颗粒料组成，原粮和颗粒料组成及营养水平见表1和2。所有试验仔鸽均由青年种鸽（法国白卡鸽×深王鸽）以“2+2”模式哺喂至28日龄。

表1 基础饲粮中原粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient levelsof raw grain in basic diet（Air-dry basis,%）

表2 基础饲粮中颗粒料组成及营养水平（风干基础）Table2 Composition and nutrient levelsof thepelleted feed in basic diet（Air-dry basis,%）

1.3 样本采集

在仔鸽饲养至28 d时，每个重复随机选取2只颈静脉放血处死，在冰上用预冷刀片、镊子采集乳鸽十二指肠组织，经预冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，一部分固定于福尔马林溶液中用于肠道组织形态发育观察；一部分保存于-80℃超低温冰箱，用于肠道组织抗氧化功能和与肠道通透性相关基因mRNA表达量检测。

1.4 十二指肠黏膜形态结构观察

采集固定在福尔马林中的十二指肠组织块经水洗、制片（脱水、透明、包埋、修块、切片）、HE染色等过程制成肠道黏膜组织切片，在光镜下观察肠道黏膜形态结构（肠道绒毛和隐窝），并拍照记录。利用软件Image-Pro Plus 6.0测量绒毛高度（Villous height）、隐窝深度（Crypt depth），计算绒隐比（V/C）。

1.5 十二指肠抗氧化功能检测

准确称取0.1 g十二指肠组织置于冰块上，按1∶9（W∶V）加入预冷PBS，使用组织破碎仪将其充分破碎后，于4℃离心机3 000 r·min-1离心20 min，取上清液制备十二指肠组织匀浆、备用。

总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,TAOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、总超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活力、丙二醛（Maleic dialdehyde，MDA）含量和乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase，LDH）活力均按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书测定。

1.6 十二指肠抗氧化酶和紧密连接蛋白相关基因mRNA表达量检测

1.6.1 RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法按照参考文献提取鸽十二指肠组织中总RNA[7]。超微量分光光度计测定RNA浓度及纯度。按照TaKaRa反转录说明书将提取的纯度较高、完整性较好的RNA反转录成cDNA，将得到的cDNA置于-20℃冰箱用于后续试验。

1.6.2 引物合成与荧光定量PCR（qPCR）

使用Oligo Primer Analysis软件（版本6.0）根据GenBank中检索相关基因序列和文献[8-9]设计引物，并由上海生工生物工程股份有限公司作引物合成。引物序列如表3所示。

表3 引物序列Table3 Primerssequences

Realtime PCR采用SYBR Green荧光染料法。按PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix试剂盒使用说明书进行。每个样品作3个重复，以β-actin为内参，作基因mRNA表达水平相对定量分析，最后采用2-ΔΔCt法计算，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct参照基因）处理组-（Ct目的基因-Ct参照基因）对照组。

1.7 统计与分析

利用Excel 2019初步整理数据，采用Graph-Pad Prism 5.0软件对数据作单因素方差分析（One-Way ANOVA），并采用Tukey′s multiple comparisons test作多重比较，P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对乳鸽十二指肠黏膜形态的影响

如图1和表4所示，与对照组相比，添加中剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比（P＜0.01）；添加高剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠绒毛高度，降低隐窝深度（P＜0.01）；但添加低剂量茶多酚对乳鸽十二指肠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比均无显著影响（P＞0.05）。

表4 茶多酚对乳鸽十二指肠形态发育的影响Table4 Effectsof tea polyphenolson duodenal morphology development of squabs

图1 茶多酚对乳鸽十二指肠组织形态学的影响Fig.1 Effects of tea polyphenols on duodenal morphology of squabs

2.2 茶多酚对乳鸽十二指肠抗氧化功能的影响

由表5可知，与对照组相比，添加低剂量茶多酚极显著降低乳鸽十二指肠MDA含量（P＜0.01）；添加中剂量茶多酚极显著降低乳鸽十二指肠MDA含量和LDH活性（P＜0.01）；添加高剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性，并降低MDA含量和LDH活性（P＜0.01）。

表5 茶多酚对乳鸽十二指肠抗氧化能力的影响Table 5 Effectsof tea polyphenols on antioxidant capacity in duodenum of squabs

由图2可知，与对照组相比，添加3个剂量的茶多酚均极显著提高仔鸽十二指肠SOD2基因mRNA表达量（P＜0.01）；添加高剂量茶多酚还极显著提高CAT基因mRNA表达量（P＜0.01）。本研究结果进一步从分子水平证实茶多酚提高仔鸽十二指肠抗氧化能力。

图2 茶多酚对乳鸽十二指肠抗氧化酶基因mRNA表达量的影响Fig.2 Effects of tea polyphenols on mRNA expression of antioxidase genes of squabs

2.3 茶多酚对乳鸽十二指肠紧密连接蛋白基因mRNA表达量的影响

由图3可知，与对照组相比，添加低剂量茶多酚极显著提高仔鸽十二指肠Occludin基因、降低Claudin-2基因mRNA表达量（P＜0.01）；添加中剂量茶多酚极显著提高仔鸽十二指肠Occludin、ZO-1基因，降低Claudin-2基因mRNA表达量（P＜0.01）；添加高剂量茶多酚极显著提高仔鸽十二指肠Occludin和ZO-1基因mRNA表达量（P＜0.01）、显著提高Claudin-3基因mRNA表达量（P＜0.05），并极显著降低Claudin-2基因mRNA表达量（P＜0.01）。

图3 茶多酚对乳鸽十二指肠紧密连接蛋白相关基因mRNA表达量的影响Fig.3 Effects of tea polyphenols on mRNA expression of tight junction protein genesof squabs

3 讨 论

在集约化家禽生产中肠道负荷经常被推到极限，肠道因特有的血管解剖结构特点以及对流氧交换机制而成为发生氧化损伤的靶器官[10]。因此，寻找提高家禽肠道抗氧化能力的方法是保证家禽肠道健康的途径之一。

肠道形态是衡量肠道健康重要指标，绒毛高度和隐窝深度分别是衡量肠道消化吸收功能和细胞成熟率主要指标。小肠绒毛变长、隐窝变浅说明绒毛发育良好，吸收能力增强，绒毛高度和隐窝深度可反映小肠功能状态，绒隐比例越大说明肠上皮表面积越大，黏膜完整性越好，肠道消化吸收能力越强[11]。十二指肠是鸽子最先接触食物的肠段，其“U”形结构特点可保证食物在小肠停留足够时间，使鸽子充分消化吸收食物。本研究表明添加一定剂量茶多酚极显著促进乳鸽十二指肠绒毛增长、绒隐比增高（P＜0.01），其中200 mg·kg-1添加量效果最好。郝洋洋研究表明，向肉鸡饲粮添加400 g·T-1茶多酚极显著增加35日龄肉鸡空肠绒毛高度[12]。Khalaji等研究表明，日粮中添加山茶提取物显著提高肉鸡肠道绒毛高度和隐窝深度，保护肠道屏障完整性[13]。本研究结果与上述文献报道相似，证明茶多酚可以改善鸽子肠道形态发育，对维护乳鸽十二指肠机械屏障有一定促进作用。

肠道细胞间紧密连接是构成肠道组织机械屏障功能的重要结构基础，在调节肠道通透性和维持肠上皮细胞机械屏障中发挥至关重要作用[14]。家禽养殖中许多肠道疾病发生发展均与肠道组织机械屏障功能有关[15]。为进一步验证茶多酚对乳鸽肠道机械屏障的影响，本试验从分子水平检测乳鸽十二指肠组织中肠道紧密连接蛋白基因mRNA表达量，结果显示，饲粮添加一定剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠组织中Occludin、ZO-1、Claudin-3基因mRNA表达量，极显著降低Claudin-2基因mRNA表达量（P＜0.01）。Occludin是重要跨膜蛋白，主要负责调控紧密连接的通透性和维持细胞极性，其减少或缺失引起肠上皮细胞间隙通透性增加[16]。ZO-1作为肠道机械屏最重要的紧密连接蛋白，可维持紧密连接结构稳定性[17]。Claudin蛋白是构成紧密连接的关键蛋白，参与紧密连接形成。Claudin-2则与上皮细胞旁孔形成、阳离子通透及水分转运相关[18]，在炎性肠病中claudin-2表达量显著升高，进而增加细胞旁细胞通透性水平，降低上皮屏障紧密度[19]。claudin-3可紧密收缩以降低细胞旁通透性，当其表达量降低时家禽肠道通透性增强[20]。ZO、Claudin、Occludin家族及细胞骨架蛋白共同维持紧密连接完整性。王元红等发现绿茶粉可增加小鼠肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相对表达量[21]。朱晟易等研究表明，绿茶通过上调Occludin和ZO-1 mRNA表达，增强大鼠小肠上皮细胞间紧密连接，进一步阻止内毒素进入机体血液循环[22]。张雨晨研究表明，绿茶粉对小鼠回肠组织ZO-1和OccludinmRNA相对表达量均有显著影响，说明绿茶粉通过增加小鼠肠道紧密连接蛋白基因表达增强小鼠肠道上皮细胞紧密连接[23]。本研究结果与上述研究一致，即适宜剂量茶多酚可使乳鸽十二指肠Occludin、ZO-1、Claudin-3基因表达量升高、Claudin-2表达量下降时，有效提高肠壁完整性，维持肠道正常通透性并降低肠道发生损伤的可能性。这也进一步证实茶多酚对维持肠道正常的机械屏障功能具有积极作用。

鸽子在养殖过程中受温度、免疫、运输等各种应激时，机体内抗氧化-过氧化体系平衡遭到破坏，氧自由基攻击肠道黏膜，导致肠道发生氧化应激损伤。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和总抗氧化能力（T-AOC）是机体内重要抗氧化物酶，在清除超氧自由基、过氧化物及阻止或减少自由基形成方面发挥重要作用。GSH-Px与过氧化氢（H2O2）特异性催化发生还原反应，可保护细胞膜结构和功能完整性。CAT酶主要作用是清除生物体内H2O2，阻止对机体有害的羟基自由基生成。T-SOD清除机体内自由基，保护细胞免受损伤；SOD有多种类型，其中SOD2（MnSOD）大部分存在于线粒体内维持其结构和功能稳定。T-AOC是反应机体自由基代谢和应激反应和抗氧化活性的综合指标。本研究结果表明，添加高剂量茶多酚极显著提高仔鸽十二指肠组织中GSH-Px活性、T-SOD活性和T-AOC活力，分子水平试验也进一步证实茶多酚通过促进SOD2和CAT基因表达提高其抗氧化能力。李玲秀研究表明，在饲粮中添加一定水平茶多酚和茶皂素可提高球虫病感染肉鸡血清和十二指肠SOD含量及T-AOC活力[24]。孙丹凤研究表明，100 mg·kg-1茶多酚提高肉鸭小肠黏膜SOD活性[25]。薛菠等研究表明，饲粮中添加0.8%绿茶粉显著增加断奶仔猪小肠黏膜抗氧化性能（GSH-Px和SOD）[26]。陆江等研究表明，茶多酚通过增强肉用仔鸡机体GSH-Px和SOD活性缓解热应激引起的氧化应激损伤[27]。李玉等研究表明，饲粮添加一定剂量茶多酚可提高犬血清中GSH-Px活性和SOD含量[28]。以上研究与本试验结果相似，即适宜剂量茶多酚或茶粉可显著提高机体和肠道组织中抗氧化酶活性。丙二醛（MDA）是脂质过氧化产物；乳酸脱氢酶（LDH）存在于机体细胞胞质内，当细胞发生氧化损伤时，细胞膜受损、LDH由胞质内泄漏。MDA含量及LDH活力一定程度上反映机体受氧自由基攻击而损伤程度。本研究发现适宜剂量茶多酚可降低乳鸽十二指肠MDA含量和LDH活性，且具有剂量依赖性。上述研究结果表明，适宜剂量茶多酚不仅激活乳鸽十二指肠抗氧化防御系统，还抑制脂质过氧化反应，进而提高肠道抗氧化能力。茶多酚提高仔鸽肠道抗氧化功能，可能与其含有直接清除自由基的成分儿茶素有关。儿茶素中含有多个酚羟基结构，羟基提供活泼氢起到灭活自由基的作用，发挥较强的抗氧化功能[29]。

4 结论

本试验条件下，饲粮添加茶多酚可改善乳鸽十二指肠肠道发育、提高十二指肠抗氧化能力并可调节与肠道紧密连接相关基因mRNA表达量，维持乳鸽肠道健康。