外伤性视神经病变动物模型的研究进展

孙 武,周 剑,巢国俊,廖 良,谢 琦,尚孟秋

(1.北京中医药大学,北京 100029;2.北京中医药大学东方医院,北京 100078;3.中国中医科学院眼科医院,北京 100040)

外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy,TON)是一类通常由眼眶、眼睛或头面部创伤引起的疾病,可导致严重的、不可逆转的视力丧失。 国际视神经创伤研究结果发现,TON 患者的平均年龄为34 岁,患病最常见的原因是机动车、自行车事故,以及袭击和跌倒事故[1]。 在闭合性颅脑损伤的患者中,TON 发病率为0.5%~5%[2]。 TON 根据引起损伤的机制分为直接外伤性视神经病变(direct traumatic optic neuropathy,DTON)和间接外伤性视神经病变( indirect traumatic optic neuropathy,ITON)。 DTON 多由枪弹、骨碎片,以及创伤造成的撕脱力或局部出血直接引起[2],ITON 则常继发于眶上缘和额颞部颅骨区钝伤,眶尖或视神经管上传递的力会引发ITON[3]。 TON 目前尚无有效的治疗措施,目前针对疾病治疗的研究方向主要集中在视神经的修复与再生[4-6]。 合适的动物模型是进行研究的重要手段,根据临床损伤类型,目前模型大体分为两种:直接损伤模型和间接损伤模型。

1 直接损伤模型

1.1 视神经横断模型(轴切模型)

视神经横断(optic nerve transection,ONT)模型造成的损伤属完全性视神性损伤,接近临床视神经断裂伤,该方法操作简单易行,可保证实验动物的损伤量一致。 步骤如下:沿头部中线从眼睛前方0.5 cm 至后方1 cm 切开后,分离筋膜至眼眶骨,清理周围组织。 逐一暴露眼部肌肉(上斜肌、内直肌、提上睑肌和上直肌)后进行牵引,显示包绕视神经的脂肪鞘。 剥离周围结缔组织,纵向切开脂肪鞘并去除脂肪,可见脑膜鞘包裹的视神经。 旋转视神经,于脑膜鞘无血管区域纵向切割,暴露白色视神经,将视神经剪断形成动物模型[7]。

ONT 模型主要用于研究视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的凋亡和存活。 研究发现,视神经横切术后14 d 损失了90%的RGC[8-10],死亡的主要机制是凋亡。 此外,轴切术后RGC 的细胞凋亡被延迟了大约4 d,为实验操作留下了时间窗口[7]。 该模型另一个优点是损伤后RGC 细胞存活率容易被定量化。 通过在切断视神经时将荧光示踪剂(3% 荧光金)应用于视神经断端,或在轴突切断前一周将示踪剂注入上丘,可以随时间追踪RGC的存活情况。

作为研究RGC 细胞凋亡的可复制模型,ONT 模型容易建立,受损标准统一。 易于定量RGC 存活率的同时,具有高度可重现的细胞死亡时间过程。 在该模型基础上可运用多种方法将靶标靶向视网膜或受损的RGC,以测试实验性治疗对眼底细胞存活的影响[11-16]。 此外,ONT 模型还能用于研究视神经的完全横断对神经系统其他部分造成的后续影响。作为直接损伤的典型模型,ONT 模型被广泛运用于DTON 的相关研究,但造模过程中损伤引起的炎症反应很难被减轻,对于后续药物或其他治疗措施的修复治疗研究较为局限。 同时它不能作为一个理想模型进行ITON 的相关研究。

1.2 视神经挤压模型

视神经挤压伤(optic nerve crush,ONC)损伤模型是用于TON 的重要实验模型,主要用于进行RGCs 存活和轴突再生方面的研究:施用示踪染料3 d 后,于4 点钟位置切开眼结膜。 钝性分离外直肌,向前牵拉眼球,暴露白色视神经。 借助交叉钳在距眼球约2 mm 处对视神经进行挤压,持续3 s[17]。 造模中需注意挤压神经用力不可过大,时间不可太长,以免造成眼动脉损伤,从而导致随后的视网膜缺血。 此外,在暴露视神经时勿损坏周围血管。

目前ONC 模型造模过程中的挤压时间差异较大,从3 s 到60 s 不等[18-24]。 根据动物类型、模拟损伤程度或造模后的分析方法不同,时间各有差异。 ONC 模型对视神经造成的挤压伤会导致RGC逐渐凋亡,可用于研究视神经元死亡和存活的一般过程。 另外,该模型在TON 的实验性药物研究中运用普遍,常被用来鉴定和测试潜在的治疗剂,以治疗不同类型的视神经病变。 ONC 模型操作简单,创伤较小,损伤明确,术后动物存活率高,具有高度可重复性。 相对于ONT 模型更为温和,可保持视神经鞘膜完整性。 该模型与ONT 模型由于操作简单、造模设备易获取等原因,是目前最常用的TON 模型。但ONC 模型仍存在夹持时间差异大、夹力大小不易控制、损伤程度难以精准定量等问题。

1.3 视神经牵拉伤模型

视神经牵拉伤动物模型类似于手术牵拉伤及部分外伤性损伤,按损伤方向可分为与视神经管平行或与之垂直。 前者类似视神经弥漫性轴索损伤,后者与视神经管骨折所致的切割伤相似。Gennarelli 等[25]利用豚鼠制作牵拉损伤模型,将豚鼠全麻后暴露视神经,固定于立体定位架上,利用汽缸-吊带-视神经的传动装置将视神经拉直,进行造模。 该模型模仿了视神经弥漫性轴索损伤。 王开仕等[26]对该模型进行简化:将大鼠球结膜切开1/4,用血管钳分离至球后,将眼球向外托出至球后与眶前骨缘齐平,随后立即恢复眼球至正常解剖位置。 该模型也出现了类似TON 的神经纤维超微结构变化,并伴有相应的电生理表现。 目前兴起的横向定量牵拉法,暴露视神经后,用聚酯缝合线于球后1~2 mm 处圈住视神经并打结,缝线另一头连接横向张力计,以不同拉力垂直于视神经方向水平牵拉并持续一定时间,进行造模。 该方法损伤易于定量,视神经受力均匀,对视网膜各个部位的损伤基本相同,且所需器械简单易控,是较理想的视神经损伤模型[27]。 但此种方法操作相对复杂,对术者要求较高,易出现手术副损伤。

目前视神经牵拉伤模型,不同动物种类的牵拉方法和作用力存在较大差别[28]。 作用力大小和作用时间缺乏统一规范,是此类模型的局限。

1.4 视神经慢性压迫损伤模型

视神经慢性压迫损伤模型可模拟外伤后血肿、周围组织的炎性水肿对视神经的慢性压迫损伤,为TON 的继发性损伤研究提供基础。 吕立权等[29]在猫模型进行造模,取目外眦及耳屏连线皮肤切开,分离肌肉、骨膜后,磨穿颅骨并扩大骨窗。 显微镜下切开硬脑膜至骨缘,排除脑脊液后, 抬起颞叶脑组织,沿蝶骨棘深入直至暴露视神经。 在视神经外侧植入不可脱球囊, 然后接导管穿皮下引至颈背部,完成造模。 吴昆旻等[30]在兔模型进行造模,经眶上缘分离切断上、内直肌,暴露视神经孔,放置一细端直径2 mm,尾端直径4 mm,高3 mm 的圆锥软硅胶于孔内,对视神经进行压迫造模。

此类造模方法简单,随着时间推移,视神经受压迫损伤也逐渐加重,可模拟出外伤后出血、肿胀逐渐加重而导致的轴突变性等病理变化[31]。 但该方法损伤无法定量,同时易于引发感染。

2 间接损伤模型

2.1 眼冲击伤模型

眼冲击伤模型模拟了炸药伤、爆破伤等产生的冲击波伤害,对于研究爆炸冲击伤所造成的TON 研究起到了重要作用。 此模型需要一套特定的操作系统,包括加压空气罐,连接空气罐的机枪管彩弹枪,在暴露动物眼睛时保护眼睛不受直接伤害和回弹伤害的密闭空间,以及可对枪管进行操控的移动平台。 将小鼠眼球位置固定后,调整预期压力,操控机枪枪口与鼠眼至合适距离,对准眼睛进行爆破,建立模型[32]。 该操作装置通过计算预期压力,然后根据预期压力确定最佳压力传感器的位置,进而调整输出压力,实现精准冲击伤。

此系统产生的损伤与眼部冲击伤患者所受损伤相似,可再现地使眼睛暴露于已知压力的冲击波中。 由于身体其余部分都受到了保护,因此所有伤害都是眼睛暴露于加压空气冲击的直接结果,且对侧眼大部分不受影响。 但此方法需要专门的操作系统,且动物死亡率高,随压力变化死亡率达24%~46%不等[32]。 受试眼承受冲击波损伤的同时会产生严重前后节损伤,视网膜组织破损严重,对视网膜组织检测造成极大干扰。 该模型仍需进一步完善。 尽管如此,这也是一个重要的新模型,可用于观察封闭式爆炸冲击波所致TON 的短期和长期病程,研究爆炸损伤引起的病理改变及其分子机制,是检测爆炸冲击伤所致TON 的潜在治疗方法的理想模型。

2.2 眼部撞击模型

眼部撞击模型所受损伤类型,以及之后的病理变化接近于临床ITON,王一等[33]在兔模型中运用闭合和开放打击法建立间接损伤视神经动物模型:(1)闭合打击法:将兔头置于工作台圆孔窗下,选致伤眼眶上缘切迹内、后各0.5 cm 为打击点,用聚乙烯板保护打击点,打击锤自由落体对准打击点进行打击造模;(2)开放打击法:耳缘静脉注射麻醉后,显露两侧眶上缘切迹和眶壁,咬骨钳向视神经管方向咬除部分眶壁骨板(深7~8 mm、宽6 mm),兔头置于致伤管下,致伤卡头卡在视神经孔上方眶板上,调整卡头和兔头角度使卡头与致伤管成一线,致伤球从管上端自由下落击于卡头。 闭合打击法组织损伤严重,对对侧眼影响较大,且造模成功率低,不宜推广。 开放性打击去处部分眶壁后打击力量更集中,所需致伤力度小,造模成功率较高。 张琳琳等[34]应用液压冲击颅脑损伤仪(fluid percussion brain injury device,FPI)产生的的冲击力打击Wistar 大鼠左、右眼眶内贴近眼球部的视神经,建立TON 模型。 造模后的闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential,F-VEP)、眼眶磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、视网膜病理等均表现出特征性变化,如F-VEP 主波潜伏期较损伤前延长、振幅降低,眼眶MRI 显示损伤部位视神经信号增高,组织病理学观测到视网膜神经元数量减少,视神经轴索萎缩变性、髓鞘肿胀等,与临床视神经损伤改变相近。

目前出现了一种微创模型:受控轨道撞击(controlled orbital impact, COI)模型[35]。 在眼内眦切开一个切口,并通过非侵入性眼球牵开器,将眼球从眼眶边缘牵开,使眼外组织暴露。 用金属撞击器尖端对ON 后2~3 mm 的眼眶区眼外组织进行撞击,创伤的强度可从轻度调整到重度。 COI 模型损伤参数(速度,挫伤深度和挫伤时间)可量化,创伤的强度可人为操控。 此模型能够实现ERG 反应减弱的可重复电生理终点,小鼠体重以及相对应的撞击速度是成功复制一致TON 结果的关键因素。 由于不涉及眼内手术,不会产生手术变异性和术中组织损伤的干扰。 冲击直接作用于眼外部位的软组织,不涉及眶上脊,因此骨折的可能性以及传递到对侧眼的创伤影响很小,造模过程不会影响到对侧视神经。 研究结果亦显示对侧眼与正常小鼠的眼睛没有显著差异,可较好地作为内部对照,减少小鼠间的个体差异[35]。 且与其他间接TON 模型(如眼冲击伤模型)相比,很少发生与损伤相关的眼部合并症(如白内障和角膜浮肿),死亡率低。 COI 模型具有侵入性小,操作简单,控制精确,重复性好等优势,并能引起不同严重程度的TON。 该模型的主要局限性是需要一个兼容软件包的专用设备设置平台,以便调整造模过程所需参数。

2.3 超声诱导的TON 模型

最近出现的超声诱导的 TON 模型[36](sonication-induced TON model,SI-TON),利用超声波产生的振动波进行造模:小鼠麻醉后,在每只鼠的眶上嵴内侧2 mm、距离中瞳孔垂直线2 mm 处放置一个带有微尖探针(直径3 mm)的实验室超声仪。 调整平台,使微尖探针与眶上直接接触,然后激活超声仪,以35%或40%的振幅发出500 ms 的电击进行造模(产生230~250 μm 的振动),对侧眼用作对照。 由于眶上嵴是解剖上最易接触到的刺激视神经管的部位,因此超声脉冲能直接通过视神经的骨骼传递并被视神经吸收,声能集中在视神经管的入口处,造成损伤。

SI-TON 模型在正确操作的情况下死亡率低,无眼部并发症,并可对RGC 计数进行量化。 该模型模拟了临床TON 损伤的机制,实现了RGC 缺失的最终结果,且在触发轴突变性和RGC 死亡的同时保留完好的组织超微结构,为评估新的治疗策略,促进RGC 存活和轴突再生提供了最宽松的环境。 损伤后炎症事件的级联序列特征也能帮助更好地理解TON 的病理生理变化。 SI-TON 模型易于实现,可重复。 同时,通过定向可调能量水平和颅骨传递,该模型可成为研究涉及单侧或双侧视神经的不同程度损伤的理想模型。 但此模型所需设备昂贵。 超声能量从原发损伤部位散射,可能对对侧视神经造成损害,尤其在小鼠这样的小型动物中,会影响对侧眼作为完全对照的效果。 此外,操作步骤要求熟练,若定位不准确,超声微尖端的错位可导致不同程度的组织损伤,甚至眼球破裂。

3 模型评价方法

总结多种造模方法,目前TON 动物模型主要采用颅前正中矢状线切口,经上睑结膜入路,通过直接或间接损伤视神经眶内段进行造模。 次日观察术眼,如出现眼底缺血、白内障等情况,造模失败;若出现瞳孔散大、眼球无明显突出、直接对光反射消失、间接对光反射存在,则可视为成功模型。 对于具体的检测评价方法,根据需求和研究方向不同,各有选择。 一般包含RGC 存活率检测,功能学检测,形态学检测等。 常见的RGC 细胞存活率检测方法,可选用荧光金标记法[7],或brn3a 免疫荧光检测[35]。 由于RGC 组织学细胞计数与视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer,RNFL)和内丛状层(inner plexiform layer,IPL)的厚度相关[37],频域相干光断层成像(spectral-domainoptical coherence tomography,SD-OCT)也可通过测量视网膜厚度从侧面反应RGC 的丢失,RNFL 和IPL 结合层厚度的减少表明视网膜中RGC 的损失。 功能检测主要包含ERG 检测及F-VEP 检测[32],其中ERG 种类较多,包含pattern ERG、flash ERG 和pSTR 等[35-36,38-40]。透射电镜、SD-OCT、MRI 等可用于形态学检测[34,36]。

4 讨论

目前TON 动物模型大致可分为直接损伤和间接损伤模型,尽管临床中最常见的损伤类型是ITON[41],当下研究普遍运用的还是ONT、ONC 及牵拉伤模型等直接损伤模型,间接损伤模型运用仍因设备缺乏、操作复杂等问题受到限制。 新的模型如SI-TON、COI 等,虽然有部分局限,但对于特定损伤类型的研究,仍提供了较大帮助。 TON 常用的动物模型包括大鼠、兔、猫等。 其中大鼠视网膜易于分离,取材后完整性较好,易铺片,目前最为常用。 现将常见模型优势及局限列于表1,以供参考。

表1 常见TON 动物模型Table 1 Common TON animal models

理想的TON 损伤动物模型应满足以下条件:(1)尽可能的复制在人体所患TON 中发现的病理变化和结局;(2)可量化和可调节的外力,能造成精准可控的局灶性视神经病变,无眼部其他部位的损伤;(3)操作简单且可复制;(4)有客观参数可量化和展现RGCs 和轴突损伤的时间过程。 对于ITON,还应尽量模拟间接闭合性颅脑外伤的临床特征,避免手术过程中直接接触视神经而造成额外的视神经损伤。

针对具体的TON 病因和研究需求,采用不同的模型是有必要的。 对直接损伤模型中ONC、牵拉模型、慢性压迫模型等的损伤程度和标准进行统一,对适合ITON 研究的新模型如COI、SI-TON 等模型做出进一步完善,以更好地开展TON 相关研究,是将来TON 动物模型研究的重要研究内容之一。