坏死性凋亡在大鼠牙移动过程中对牙周组织改建的影响

季开心，陈思言，张敏杰，张苗苗

正畸牙齿移动是外力作用下引发的无菌性炎症反应，可以使牙周组织发生损伤与重建[1]。加力后牙周微环境的稳态被打破，牙周组织的微循环受到干扰，压力侧局部组织缺血、血管压缩，白细胞发生迁移[2]。当组织适应机械外力后，牙周微环境发生改变，细胞损伤程度加重，触发细胞死亡，引起炎症性改变，释放炎症介质、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)等，共同调节破骨细胞分化[3]。RANKL与OPG的表达含量可以代表牙周组织改建的活跃程度[4-6]。

有研究发现牙齿移动过程中表达坏死性凋亡的关键蛋白——受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein 1/3，RIP1/3)，提示坏死性凋亡参与了牙齿移动过程。坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)可以降低坏死性凋亡的发生率[7-9]。本课题组前期实验发现在正畸牙齿移动过程中存在坏死性凋亡，但坏死性凋亡如何参与牙齿正畸过程中牙周组织的改建目前尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

正畸结扎丝(新亚，中国)；6 mm镍钛拉簧(速航科技，中国)；酸蚀剂(杭州生物，中国)；粘结剂、树脂(3M，美国)；游标卡尺(美耐特，中国)；石蜡切片机(瑞沃生命科技，中国)；全自动脱水机(上海三葳医疗，中国)；组织包埋机(泰维科技，中国)；光学显微镜(徕卡，德国)；水合氯醛(科密欧，中国)；多聚甲醛(金穗化工，中国)；EDTA(九州化工，中国)；Nec-1(MCE，中国)；兔抗鼠RANKL多克隆抗体、兔抗鼠OPG多克隆抗体(Affinity，中国)；SABC免疫组化试剂盒(博士德，中国)；DAB显色试剂盒(卡诺斯，中国)。

1.2 构建牙齿移动模型与实验分组

选择6周龄雄性SD大鼠80只，体质量为(206.43±10.43)g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，适应性喂养1周后进行实验。本实验获得哈尔滨医科大学伦理委员会批准。10%水合氯醛溶液进行大鼠腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)后，将6 mm镍钛拉簧两端用光固化流动树脂分别固定在上颌切牙以及左侧第一磨牙处，保持拉簧力值为50 g，同时磨短下颌切牙，建立正畸牙齿移动(orthodontic tooth movement，OTM)模型。按照是否加力以及注射Nec-1，将大鼠随机分为对照组(A组)、抑制剂组(B组)、加力组(C组)、加力+抑制剂组(D组)。C、D两组构建OTM模型，A、C两组分别在第1、3、7、10、14天上午8时腹腔注射生理盐水，注射剂量为1 mg/(kg·d)，B、D两组于同一时间腹腔注射Nec-1，注射计量为1 mg/(kg·d)。

1.3 组织取材

各组大鼠在注射药物当天下午5时进行麻醉后依次灌注生理盐水以及多聚甲醛溶液，取大鼠上颌左侧颌骨组织，以待后续操作。

1.4 牙齿移动距离测量

游标卡尺测量左侧第一磨牙近中边缘嵴与第三磨牙远中边缘嵴距离，移动距离为两次测量距离之差，由同一实验者测量3次，取3次平均值。

1.5 制备切片

多聚甲醛对大鼠上颌骨标本体外固定，使用EDTA对标本脱钙后，石蜡脱水包埋。沿牙体长轴矢状向连续切片，每个切片厚度在4 μm左右，恒温烤片2 h，对上颌左侧第一磨牙压力侧牙周组织进行HE染色和免疫组织化学染色，染色后显微镜观察。

1.6 HE染色

将切片用苏木精溶液进行染色5 min，稀氨水(1%)浸泡30 s，伊红溶液染色1 min，应用中性树脂封胶处理，显微镜下观察。

1.7 免疫组化染色与平均光密度测量

切片用山羊血清封闭处理并与一抗RANKL抗体(浓度1∶300)和OPG抗体(浓度1∶250)共同孵育过夜后，再与二抗(浓度1∶200)继续孵育4 h。孵育后用DAB检测试剂盒显色，利用Image-Pro-Plus9.0进行阳性细胞分析，计算平均光密度。

1.8 统计学方法

所有数据均使用SPSS 17.0进行单因素方差分析，组间数据对比应用独立样本t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠第一磨牙移动距离

A、B组牙齿在各实验时间点均无移动。第3、7、10、14天时，C、D组第一磨牙均向近中明显移动，且C组牙齿移动距离较D组明显增加(P<0.05)，如表1所示。

表1 大鼠牙齿移动距离

2.2 大鼠上颌第一磨牙压力侧玻璃样变变化

切片HE染色后发现，A、B两组大鼠第一磨牙在各实验时间点均未出现明显的玻璃样变区域。C组第一磨牙在第1、3天时未发现明显的玻璃样变区域；第7天可以观察到压力侧出现大面积玻璃样变区域，牙周膜间隙缩窄，胶原纤维发生断裂；第10天时玻璃样变区域变小，牙周膜间隙略增宽；第14天时玻璃样变区域持续减小，牙齿移动。D组加入Nec-1后，第一磨牙压力侧第1、3、7天时出现的玻璃样变区域不明显，牙周膜间隙缩窄，在第10天时压力侧出现明显的玻璃样变区域，第14天时玻璃样变区域减少(图1)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；红色箭头代表大面积玻璃样变区域

2.3 大鼠第一磨牙压力侧RANKL、OPG变化

本实验中，A、B组在第1、3、7、10、14天RANKL、OPG表达无明显差异(P>0.05)。C组中RANKL、OPG表达随着时间逐渐递增，RANKL在第7天时表达达到高峰，OPG在第10天时表达达到顶峰，之后随着加力时间的增加，表达呈下降趋势，各实验时间点表达均高于A组(P<0.05)。加入坏死性凋亡抑制剂Nec-1后，D组中RANKL、OPG表达趋势与C组一致，较A、B组表达增强；第7、10天时，C、D两组RANKL、OPG比较有统计学意义(P<0.05)(图2～3，表2～3)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；红色箭头代表阳性表达

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；红色箭头代表阳性表达

表2 不同加力时间大鼠第一磨牙压力侧RANKL平均光密度值变化

表3 不同加力时间大鼠第一磨牙压力侧OPG平均光密度值变化

3 讨 论

坏死性凋亡是一种与炎症相关、受细胞调节的死亡过程[10-11]。当细胞中caspase缺失或被抑制，受体相互作用蛋白激酶RIP1和RIP3在肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)诱导下，募集MLKL形成坏死小体，发生坏死性凋亡。Nec-1是一种小分子生物碱，可以有效抑制坏死性凋亡，避免细胞发生坏死[12]。单独应用Nec-1对健康细胞中的ATP水平、线粒体膜电位、质膜完整性、细胞形状、细胞分化以及增殖等均无影响[13-14]。本实验仅使用Nec-1后，RANKL与OPG的表达与对照组相比无明显差异，提示Nec-1不直接影响RANKL与OPG的表达。而在加力时使用Nec-1，牙齿移动距离缩短，证明坏死性凋亡参与了牙齿移动过程。

坏死性凋亡在细胞死亡中发挥促炎作用[15]。与其他类型的细胞死亡方式相比，坏死性凋亡的独特性在于其会触发危险相关分子模式(DAMPs)进而引发炎症。当牙周组织发生大量炎症反应时，其本身不能发生适应性改建后则出现玻璃样变区域，阻碍牙齿移动。本实验中，加入抑制剂Nec-1可以使加力后压力侧出现大范围的玻璃样变区域变晚，提示抑制坏死性凋亡会延迟玻璃样变出现的时间，但坏死性凋亡与玻璃样变之间的关系仍有待进一步研究。

破骨细胞的形成以及骨改建激活取决于牙周组织中细胞因子的表达含量[16-17]。破骨细胞分化成熟后可吸收压力侧牙槽骨，促使牙齿移动。在压力侧微环境中，RANKL、OPG以及RANK都发挥着重要的作用[18]。研究发现OPG在破骨细胞形成过程中呈现先升高后降低的趋势，可抑制破骨细胞形成，减缓牙齿移动[18]。Aoki等[19]、Noguchi等[20]实验证实，增加RANKL含量会上调破骨细胞前体中的RANK表达，加快破骨细胞形成，提高牙齿移动速度。本实验中，大鼠单独进行加力后，RANKL与OPG的表达呈现先升高后降低的趋势，与破骨细胞形成规律相一致，提示在正畸牙齿移动过程中引发的无菌性炎症反应，可以使RANKL与OPG的表达增高，参与破骨细胞形成。加力时使用Nec-1可减少RANKL与OPG的表达，提示抑制牙周组织中坏死性凋亡的发生，可以减轻牙周组织中的炎症反应，影响破骨细胞的形成与分化。以上结果提示，在牙齿移动过程中，正畸力可能会激发压力侧牙周组织产生坏死性凋亡，发生坏死性凋亡后，压力侧牙周组织环境发生改变，炎症反应程度逐渐加重，刺激成骨细胞分泌RANKL等细胞因子，帮助破骨细胞形成与分化，促使牙齿移动。当使用Nec-1后，坏死性凋亡被抑制，压力侧牙周组织炎症反应减轻，破骨细胞形成与分化不活跃，牙槽骨改建速度下降，造成牙齿移动速率变缓。

综上所述，坏死性凋亡可以促进牙齿移动，还可能导致了玻璃样变的发生，但坏死性凋亡与牙齿移动之间的关系还需更多实验的支持。本实验以期能为牙齿移动机制提供新思路，为更加深入了解坏死性凋亡与牙齿移动的关系提供新视角。