藏药珊瑚七十味丸对高脂血症模型大鼠的降脂作用及机制研究

春花 魏丹丹 朱星昊 吴宗耀 达娃扎巴

摘 要 目的 研究藏药珊瑚七十味丸对高脂血症（HLP）模型大鼠的降脂作用，并初步探讨其作用机制。方法 将60只SD大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、辛伐他汀组（阳性对照，20 mg/kg）和珊瑚七十味丸低、中、高剂量组（50、100、200 mg/kg），每组10只。正常组大鼠饲喂常规饲料，其余各组大鼠饲喂高脂饲料建立HLP模型，连续喂养4周。各给药组大鼠在造模同时即开始灌胃相应药物，正常组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续4周。末次灌胃后，检测各组大鼠血清中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，观察各组大鼠肝组织病理变化，测定各組大鼠肝组织中AMP活化蛋白激酶1（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、肝激酶B1（LKB1）、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）蛋白的表达情况。结果 低、中、高剂量珊瑚七十味丸均可显著降低HLP模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平以及肝组织中HMGCR蛋白表达水平（P<0.05），显著升高HLP模型大鼠血清中HDL-C水平及肝组织中AMPK磷酸化水平、LKB1蛋白表达水平（P<0.05），不同程度地改善HLP模型大鼠肝组织的病理变化。结论 珊瑚七十味丸能降低HLP模型大鼠的血脂水平;其机制可能与抑制LKB1/AMPK信号通路的传导，从而调节脂代谢相关。

关键词 珊瑚七十味丸;高脂血症;肝激酶B1;AMP活化蛋白激酶1;3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶

中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2022）01-0046-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.01.08

ABSTRACT OBJECTIVE To study the effects of Tibetan medicine Shanhu qishiwei pill in lowering blood lipid of hyperlipidemia （HLP） model rats，and to explore its mechanism primarily. METHODS According to their body weigh，60 SD rats were randomly divide into normal group，model group，simvastatin group （positive control，20 mg/kg） and Shanhu qishiwei pill low-dose，medium-dose and high-dose groups （50，100，200 mg/kg），with 10 rats in each group. Normal group was given conventional diet，and other groups were given high-lipid diet to induce HLP model，for consecutive 4 weeks. Administration groups were given relevant medicine intragastrically at the same time of modeling; normal group and model group were given equal volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 4 weeks. After last administration，the serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C were determined; pathological changes of liver tissue were observed; the protein expressions of AMPK，p-AMPK，LKB1，and HMGCR in liver tissue were detected in each group. RESULTS Low-dose，medium-dose and high-dose of Shanhu qishiwei pill could significantly reduce the serum levels of TC，TG and LDL-C and protein expression of HMGCR in liver tissue （P<0.05），while significantly increased serum level of HDL-C，phosphorylation level of AMPK，protein expression of LKB1 in liver tissue in HLP model rats （P<0.05）; the pathological changes of liver tissue in HLP model rats were improved to different extents. CONCLUSIONS Shanhu qishiwei pill can reduce the blood lipid level of HLP model rats，and its mechanism may be related to inhibiting the transmission of LKB1/AMPK signal pathway and regulating lipid metabolism.

KEYWORDS Shanhu qishiwei pill; hyperlipidemia; LKB1; AMPK1; HMGCR

藏医药是中国传统医学的重要组成部分，已经有   2 000多年的历史，并以其独特的理论体系和丰富的诊疗方法受到人们的关注。藏药珊瑚七十味丸出自《四部医典》，具有镇心、安神、定惊、调血之功效，临床用于冠状动脉粥样硬化、心肌梗死、高脂血症（hyperlipidemia，HLP）和失眠等疾病的治疗，而冠状动脉粥样硬化、心肌梗死等多种疾病均是HLP的关键危险因素[1-3]。随着人们生活水平的提高及生活习惯的改变，我国HLP的发病率高达40.40%[4-6]。本团队前期通过临床观察发现，珊瑚七十味丸能降低HLP患者总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等指标;此外，本团队前期还对珊瑚七十味丸中铜、铅、镉、砷、汞5种重金属含量进行了测定[7]。通过以上研究发现，珊瑚七十味丸是一种安全、有效的HLP治疗药物。但是，珊瑚七十味丸治疗HLP的分子机制尚不清楚，影响了该药的临床应用。

目前，越来越多的研究证实，HLP的发生发展与肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）/AMP活化蛋白激酶1（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路相关。LKB1/AMPK是脂代谢相关通路，其中AMPK蛋白是所有真核生物的中央代谢“开关”，控制葡萄糖和脂质代谢，以响应营养物质和细胞内能量水平的变化[8]。LKB1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可直接磷酸化并激活AMPK，调节肝脏、肌肉和脂肪等组织的功能，以代谢组织中的脂质、胆固醇和葡萄糖[9]。因此，本研究通过饲喂高脂饲料的方法制备HLP大鼠模型，观察珊瑚七十味丸对其血脂指标（TC、TG、HDL-C、LDL-C）及LKB1/AMPK信号通路相关蛋白的影响，探讨珊瑚七十味丸的降血脂作用及分子机制，为该药的临床应用提供实验依据，也为其深度开发奠定基础。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有BS110S型电子天平（北京赛多利斯天平公司），MR-96TB型酶标仪[骋克仪器（上海）有限公司]，RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司），D3024R型台式高速冷冻型微量离心机[大龙兴创实验仪器（北京）有限公司]，YD-6D型组织包埋机、YD-A型组织摊片机、YD-B型组织烤片机（金华市科迪仪器设备有限公司），CX23型光学显微镜（日本Olympus公司），NanoDrop2000型超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用的主要药品与试剂有珊瑚七十味丸（西藏雄巴拉曲神水藏药有限公司，批号2020040302，规格1 g/丸），辛伐他汀片[华润双鹤利民药业（济南）有限公司，批号1810409，规格10 mg/片]，氨基甲酸乙酯（天津百伦斯生物技术有限公司，批号20200326），TC、TG、HDL-C、LDL-C测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1），兔SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为SP-9001、ZLI-9018），BCA蛋白定量检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制备试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为G2026、G2003），兔抗大鼠AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、LKB1、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3 methylglutaryl coenzyme areductase，HMGCR）单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bs-10344R、bs-12972R、bs-3948R、bs-5068R），兔抗大鼠β-肌动蛋白（β-actin）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为GB11001、GB23303）;其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 动物

本研究所用动物为健康SD大鼠，共60只（雌雄各半），体质量为180～200 g，鼠龄为8周，由郑州市惠济区华兴实验动物养殖场提供，实验动物生产许可证号为SCXK（豫）2019-0002。本实验得到了河南中医药大学动物伦理委员会的批准（批准号为DWLL20180018），实验过程严格遵守“3R”原则。实验期间动物饲养室环境温度为20～22 ℃、相对湿度为55%～60%、正常光照，大鼠自由饮水采食。

2 方法

2.1 动物分组、给药与造模

将60只SD大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、辛伐他汀组（阳性对照，20 mg/kg，为成人临床给药剂量的7倍等效剂量）和珊瑚七十味丸低、中、高剂量组（50 、100 、200 mg/kg，分别为成人临床给药剂量的3、6、12倍等效剂量），每组10只，雌雄各半。适应性喂养1周后，模型组、辛伐他汀组和珊瑚七十味丸低、中、高剂量组大鼠饲喂高脂饲料（含68%基础饲料、10%白糖、10%猪油、10%蛋黄粉、2%胆固醇）以制备HLP模型，正常组大鼠饲喂常规饲料，连续喂养4周[10]。辛伐他汀组和珊瑚七十味丸低、中、高剂量组大鼠在造模同时即开始灌胃相应药物进行干预，正常组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃体积均为10 mL/kg，每天1次，连续4周。

2.2 生化指标检测

末次灌胃后，各组大鼠禁食不禁水12 h，以氨基甲酸乙酯1 g/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离（4 ℃，3 000 r/min，10 min）大鼠血清，按照相应试剂盒方法检测血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

2.3 病理检查

采用苏木精-伊红（HE）染色法进行检查。取血后，解剖并取大鼠肝组织。取各组大鼠相同位置的肝组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋、切片（厚度为4 μm），行HE染色，然后将切片置于显微镜下观察肝组织的病理改变。

2.4 肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表达情况检测

2.4.1 免疫组化法检测 取“2.3”项下肝组织病理切片，经脱蜡、水化后，以H2O2封闭、磷酸盐缓冲液（PBS）清洗、柠檬酸盐缓冲液热修复8 min后，以山羊血清封闭，室温孵育30 min;分别滴加AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR抗体（稀释比例均为1 ∶ 100），4 ℃孵育过夜;加入二抗（稀释比例为1 ∶ 200），37 ℃孵育20 min;DAB法显色，自来水冲洗，苏木精复染3 min，盐酸乙醇分化;经自来水冲洗、脱水、透明、封片后，在显微镜下进行观察，并采用Image-Pro Plus 6.0软件测定每个视野中目的蛋白阳性染色（即棕黄色区域）的积分光密度（integrated optical density，IOD）值，IOD值越高表明目的蛋白的表达水平越高。

2.4.2 Western blot法检测 取大鼠肝组织适量，加入含1%磷酸酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液，匀浆后，在4 ℃下以13 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA蛋白定量法测定上清液中蛋白浓度。将蛋白高温变性后，取100 μg进行SDS-PAGE（分离胶电压120 V，浓缩胶电压75 V，电泳时间2 h），转移至聚偏二氟乙烯膜（电流300 mA，转膜时间30 min），5%脱脂奶粉封闭2 h;分别加入AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR一抗（稀释比例均为1 ∶ 1 000）和β-actin一抗（稀释比例为1 ∶ 3 000），4 ℃孵育过夜;洗膜后，加入二抗（稀释比例为1 ∶ 10 000），振荡孵育1 h;ECL显影并扫描，通过Image J 1.51软件测定蛋白条带灰度值，以LKB1、HMGCR与内参β-actin条带灰度值的比值表示LKB1、HMGCR蛋白的表达水平，以p-AMPK与AMPK条带灰度值的比值表示AMPK的磷酸化水平。

2.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，绘图软件主要采用GraphPad Prism 7.0。所得实验数据均采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 珊瑚七十味丸对HLP模型大鼠生化指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均显著升高（P<0.05），HDL-C水平显著降低（P<0.05）。與模型组比较，各给药组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均显著降低（P<0.05），HDL-C水平均显著升高（P<0.05）。各组大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平测定结果见表1。

3.2 珊瑚七十味丸对HLP模型大鼠肝组织病理变化的影响

正常组大鼠肝细胞形状规则，呈索状分布;细胞边界清晰，胞浆内未见脂肪滴。模型组大鼠肝细胞形态不规则，边界模糊;细胞肿胀且大小不一致，胞浆内可见大量脂肪滴。各给药组大鼠肝组织的病理变化均较模型组不同程度地改善，胞浆内仅存在少量脂肪滴。各组大鼠肝组织的病理观察结果见图1。

3.3 珊瑚七十味丸对HLP模型大鼠肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表达的影响

3.3.1 免疫组化实验结果 与正常组比较，模型组大鼠肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白的IOD值均显著降低（P<0.05），HMGCR蛋白的IOD值显著升高（P<0.05）。与模型组比较，各给药组大鼠肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白的IOD值均显著升高（P<0.05），HMGCR蛋白的IOD值均显著降低（P<0.05）。各组大鼠肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的免疫组化图见图2，IOD值测定结果见表2。

3.3.2 Western blot实验结果 与正常组比较，模型组大鼠肝组织中AMPK磷酸化水平和LKB1蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），HMGCR蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与模型组比较，各给药组大鼠肝组织中AMPK磷酸化水平和LKB1蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），HMGCR蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。各组大鼠肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的电泳图见图3，磷酸化水平/蛋白表达水平测定结果见表3。

4 讨论

藏药珊瑚七十味丸具有较好的降血脂作用，该药由珊瑚、珍珠、玛瑙、当归、藏党参、红景天、雪莲花、余甘子、藏红花、黄精、牛黄、麝香等70味藏药组成[11]，具有镇心、安神、定惊、调血之功效，临床主要用于脑血栓、脑溢血、冠心病、高血压等病的治疗[12-13]。虽然《四部医典》中没有关于藏药珊瑚七十味丸降血脂作用的相关记载，但由于HLP是心脑血管疾病发生的重要因素，且临床研究发现该药具有较好的降血脂作用，具有较高的临床应用价值。辛伐他汀是一种羟甲基戊二酰辅酶A（hydroxymethylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）还原酶抑制剂，可以有效降低血脂水平，也是目前临床最为常用的降血脂药物[14]。基于以上思路，本研究制备了HLP大鼠模型，以辛伐他汀为阳性对照药物，探讨了珊瑚七十味丸对HLP模型大鼠的干预作用。结果发现，珊瑚七十味丸干预后，HLP模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平均显著降低，HDL-C水平显著升高。此外，本研究通过HE染色发现，珊瑚七十味丸各剂量组大鼠肝组织的病理改变程度均明显减轻。可见，珊瑚七十味丸具有明显的降血脂作用。

AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能参与机体的能量代谢调节过程，其在肝组织中主要激活LKB1/AMPK通路[15]。当细胞内腺嘌呤核苷一磷酸/腺嘌呤核苷三磷酸升高时，AMPKα亚基上的Thr172位点可被LKB1磷酸化为p-AMPK而激活[8，16-17];p-AMPK则可以通过单磷酸腺苷活化AMPK、HMG-CoA等，从而影响肝组织脂肪酸摄入[18]。本研究采用免疫组化法和Western blot法观察珊瑚七十味丸对LKB1/AMPK通路相关蛋白表达的影响。免疫组化实验结果显示，与模型组比较，珊瑚七十味丸低、中、高剂量组大鼠肝组织中有大量AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白沉积，有少量HMGCR蛋白沉积;Western blot法实验结果显示，与模型组比较，珊瑚七十味丸低、中、高剂量组大鼠肝组织中AMPK磷酸化水平和LKB1蛋白表达水平均显著升高，HMGCR蛋白表达水平均显著降低。两种方法检测结果的蛋白表达趋势一致，说明珊瑚七十味丸可抑制LKB1/AMPK信号通路的传导。

综上所述，珊瑚七十味丸可能是通过抑制LKB1/AMPK信号通路的传导来降低HLP模型大鼠的血脂水平。但由于珊瑚七十味丸药味繁多，其有效物质并未阐明。在今后的研究中，本课题组将开展其药效物质基础研究，为该药的临床应用提供依据。

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（收稿日期：2021-09-09 修回日期：2021-11-30）

（编辑：林 静）