可溶性Neuropilin-1在早期宫颈鳞状细胞癌中的诊断价值*

朱晓武， 杨守华

华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉 430022

宫颈癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一，在发达国家，由于宫颈癌筛查的普及，大多数病例在在癌前病变阶段就得到了诊断和治疗；但在多数发展中国家，宫颈癌还是导致女性病死的主要原因之一。在世界范围内，其发病率和死亡率均为女性恶性肿瘤的第4位[1]。血管新生和宫颈癌预后不佳或复发密切相关[2]。在宫颈癌的发生发展过程中，血管新生是一个重要的病理过程，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族成员及其受体在这个过程中起关键的调节作用。目前在许多肿瘤中，VEGF和它的受体VEGFR-1，VEGFR-2和Neuropilin-1(NRP-1)已经成为重要的靶向治疗靶点。作为VEGF受体的NRP-1在多种实体肿瘤中都过表达并参与肿瘤的进程，可溶性的NRP-1(soluble NRP-1，sNRP-1)可以发挥拮抗细胞相关NRP-1功能的作用[3-5]。在前期研究中我们报道了sNRP-1和NRP-1蛋白在宫颈病变中的表达[6]，在本研究中，我们分别检测了早期宫颈鳞状细胞癌和癌前病变患者血清中的sNRP-1水平，结合对照进一步分析其在宫颈疾病的早期诊断和预后中可能的价值。

1 材料与方法

1.1 标本

血清样本来自华中科技大学附属协和医院2012年1月至2014年4月期间住院治疗的患者，其中宫颈癌前病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)组患者18例，均为CINⅡ～Ⅲ级(含原位癌)；早期宫颈癌鳞癌(squamous cervical cancer，SCC)组患者31例，依据国际妇产科联盟(FIGO，2000)的标准，均为从Ⅰa1到Ⅱa期患者；同期收集的20例对照组均为因子宫肌瘤或子宫腺肌症来我科行妇科手术的患者，术前检查排除宫颈病变或其他有恶性肿瘤史的患者。纳入本研究的患者平均年龄44.7岁(24～66岁)。所有病例术前均未接受放化疗并在术后得到病理检测证实，所有的浸润癌病例都进行了“广泛子宫全切+盆腔淋巴结清扫术”，其中有盆腔淋巴结转移者9例，无转移者22例，盆腔淋巴结状态真实可靠。

1.2 试剂和方法

人NRP-1 ELISA试剂盒购自Cloud-clone Corp.(Huston，Texas)，所有操作根据试剂盒说明书推荐的方案，采用标准的ELISA方法检测血清中的sNRP-1的浓度，重复3次，取平均值。研究所涉及的血样均在早上采集，并在4 ℃离心以回收血清，所有血清样本均临时储存于-80 ℃，每3个月分批集中用于实验。sNRP-1的浓度通过人NRP-1免疫测定进行定量，其测量范围为0.313至20 ng/mL。将标准品或样品加入到由生物素偶联的人NRP-1特异抗体包被的微量滴定板小孔中，接下来将结合了辣根过氧化物(HRP)的抗生物素蛋白加入到每个孔中并孵育添加TMB底物溶液后，通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并使用分光光度计在(450±10)nm波长下进行测量。根据通过标准品绘制的标准曲线，比较吸光度(A)值来确定样品中sNRP-1的浓度。

1.3 统计学方法

所有的分析都在SAS 6.12(SAS Institute，Cary，NC)或SPSS 12.0上进行。连续变量的描述采用平均值±标准差，采用线性回归分析ELISA所得数据，血液循环中sNRP-1的水平与临床分期、转移与否等临床参数的关系采用T检验和one-way ANOVA。ROC曲线用于分析sNRP-1的诊断价值，无瘤生存曲线(DFS)用于分析不同sNRP-1水平的宫颈癌患者的预后情况。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 sNRP-1在血清中的表达水平及意义

31例早期SCC和18例CIN患者血清中sNRP-1的水平均较对照组显著升高[(11.41±0.52)ng/mLvs.(9.22±0.09)ng/mL，P=0.0016；(11.80±0.52)ng/mLvs.(9.22±0.09)ng/mL，P=0.0041]，而早期SCC组与CIN组之间差异并无统计学意义[(11.41±0.52)ng/mLvs.(11.80±0.52)ng/mL，P=0.6891，见图1A]。将31例SCC患者按盆腔淋巴结是否转移来进一步分组后发现，盆腔淋巴结阳性组的sNRP-1显著升高[(13.31±1.09)ng/mLvs.(10.64±0.52)ng/mL，P=0.0177，见图1B]。

2.2 sNRP-1对早期SCC和CIN患者的诊断价值分析

我们采用ROC曲线分析对照与CIN和早期SCC患者血清中的sNRP-1水平，研究sNRP-1是否对早期宫颈病变具有诊断价值。ROC曲线研究发现早期SCC患者血清sNRP-1水平与对照组之间存在显著差异，AUC为0.8192，95%置信区间为0.7032～0.9352，P=0.0002(图2A)；对CIN组，也有相似的结论，AUC为0.7885，95%置信区间为0.6379～0.9352，P=0.0029(图2B)；将CIN组和早期SCC组合并后与良性对照比较，AUC为0.8072，95%置信区间为0.7068～0.9076，P<0.0001(图2C)。

A：sNRP-1对早期SCC的诊断价值；B：sNRP-1对CIN的诊断价值；C：sNRP-1对早期SCC和CIN的诊断价值图2 ROC曲线评估sNRP-1在早期SCC组和(或)CIN组中的诊断价值Fig.2 The diagnostic value of sNRP-1 for early stage SCC group and(or)CIN groups by ROC analysis

这些结果提示sNRP-1作为潜在的早期SCC和CIN血清学诊断指标的可行性，通过ROC分析，对不同的sNRP-1水平作为诊断临界点及其敏感度和特异度的分析。对早期宫颈鳞癌和癌前病变，sNRP-1值为8.808、8.969、9.131、9.293、9.535和9.778 ng/mL时对应的敏感度(%)分别为97.96、87.76、79.59、73.47、65.31和59.18，特异度(%)分别为5.263、36.84、57.89、73.68、84.21和89.47。据此，sNRP-1为9.535 ng/mL是最佳的诊断阈值(敏感度和特异度之和最高)，此时其敏感度为65.31%，特异度为84.21%，相似比4.14。

2.3 sNRP-1对早期宫颈鳞状细胞癌预后的预测价值

根据2.2的结果，以sNRP-1=9.535 ng/mL为节点，将31例早期宫颈鳞癌分为高sNRP-1组(19例)和低sNRP-1组(12例)，我们对其预后进行随访。因为纳入本研究的样本量较小，到2018年12月底，死亡患者仅5例，复发患者有12例，我们以患者复发为主要参考指标，研究不同组别无瘤生存时间(DFS)的差异。随访时间为6～52个月，平均为36.9个月。结果发现低sNRP-1组仅有2例复发，高sNRP-1组有10例复发，两组之间的DFS之间差异存在统计学意义，提示sNRP-1对宫颈鳞状细胞癌有预后价值(图3)。

低sNRP-1组：sNRP-1≤9.535 ng/mL；高sNRP-1组：sNRP-1>9.535 ng/mL图3 sNRP-1对早期宫颈鳞状细胞癌的预后价值Fig.3 Prognostic value of sNRP-1 in patients with early cervical squamous cell carcinoma

3 讨论

实体肿瘤的生长和转移离不开血管新生，随着VEGF家族在这个病理过程中的作用被逐步揭示，研究表明VEGF家族成员主要通过其受体如VEGFR-1、VEGFR-2和NRP-1发挥作用[7]。NRP-1是一个跨膜受体，不仅可以结合VEGF并与VEGFR-2形成复合物，而且还可以结合结构和功能上不相关的传统轴突引导信号SEMA-3。与VEGF的主要受体相比，NRP-1与多种配体和受体共同调控血管新生的机制尚未完全明确[4，8]。NRP-1通过VEGFR-2独立调节内皮细胞对细胞外基质蛋白的粘附，基于其作为VEGF活性增强剂和内皮细胞粘附介体的双重作用，NRP-1也成为抗血管生成药物的分子靶标。内皮细胞表达NRP-1，并且在结合VEGF-A以增强血管生成后，NRP-1与受体酪氨酸激酶VEGFR-2结合[9-10]。然而，sNRP-1被认为是NRP-1的拮抗剂，可以抑制NRP-1蛋白的功能[5]。NRP-1过表达在多种人类癌症中都有报道，包括那些源自前列腺癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌和脑癌的癌症[11-16]。在大多数实体瘤中，NRP-1的高表达与临床分期、血管生成、结节浸润和较差的总生存率显着相关[5，12-13，15，17]。

近年来，以NRP-1参与肿瘤进程的机制和以其为靶点的抗肿瘤治疗研究也取得了初步进展，例如有研究发现NRP-1拮抗剂可以抑制肿瘤间质内的NRP-1(+)Tregs，进而达到抑制肿瘤进展的作用，对肿瘤外的Tregs影响有限，而NRP-1(+)Tregs在肿瘤的发生发展中又发挥了重要作用[18-19]。在胰腺癌中，通过对12个候选miRNAs的研究发现，miR-141具有最强负向调节NRP-1的能力，miR-141/NRP-1具备成为胰腺癌肿瘤标记分子和治疗靶点的潜力[20]。在胃癌细胞中，miR-9-5p通过抑制NRP-1的表达来抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力[21]。另有研究发现抗NRP-1单克隆抗体可以下调其裸鼠荷瘤模型中VEGF的表达水平，在体外实验中该抗体可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，其机制可能是通过抑制Akt的磷酸化[22]。这些研究提示NRP-1参与了肿瘤的侵袭和迁移，而且是极具潜力的抗肿瘤治疗的靶点。

在本研究中，我们通过ELISA检测发现与良性对照相比，在早期SCC和CIN患者血清中的sNRP-1水平显著增高，但CIN组和早期SCC组患者间并无差异，提示sNRP-1水平的升高是宫颈癌发生发展过程中存在于癌前病变阶段的一个早期事件。进一步分析ROC曲线，发现这种增高具备诊断早期宫颈鳞癌和CIN的潜力，结合敏感度和特异度分析，我们认为sNRP-1等于9.535 ng/mL时是最佳的诊断节点，此时其敏感度为65.31%，特异度为84.21%。同时经过对31例患者DFS分析，我们发现高sNRP-1患者的预后较低sNRP-1患者预后更差，两组之间差异具有统计学意义。除了本课题组外，Yang等[23]也在河南省的宫颈癌患者中发现NRP-1蛋白在CIN和宫颈癌中均显著升高，而且NRP-1表达水平的升高与不良预后有关，提示其为宫颈癌的独立预后因素，我们的研究结果与该研究一致。同时另有研究表明在宫颈癌局部缺氧的微环境下，可以通过NRP-1来激活M2样的肿瘤相关巨噬细胞TAM参与到宫颈癌的发展中。鉴于TAM在宫颈癌发展中的重要作用，提示NRP-1有望作为宫颈癌的靶向治疗位点[24]。

综上所述，我们研究发现sNRP-1在宫颈癌前病变和早期宫颈鳞癌中均显著上升，而且sNRP-1浓度在9.535 ng/mL时，其诊断早期宫颈病变的敏感度为65.31%，特异度为84.21%，同时sNRP-1对早期宫颈癌的预后具有预测价值。本研究显示sNRP-1是极具潜力的早期宫颈鳞状细胞癌肿瘤标记分子，同时我们的结论还有待更大样本的研究证实后推广。