表面活性剂与脂肪酶ZG复配在皮革脱脂工艺中的应用研究

王文靖，陈倩，张晓伟，刘彦，＊

（1.四川大学生物质与皮革工程系，四川 成都 610065；2.四川大学制革清洁技术国家工程研究中心，四川 成都 610065）

前言

脱脂不仅需要去除生皮表面的油脂，同时还要将生皮内部脂腺中的油脂以及游离脂肪细胞中的油脂除去，因此，要想彻底的去除油脂，皮革脱脂材料不仅需要具备良好的去污能力，还应具有渗入皮层内部将脂肪及脂腺细胞中的油脂迁出皮外的能力[1]。目前制革中主要是应用表面活性剂进行脱脂（又称乳化法脱脂），不仅脱脂率较高，且对后工序具有良好的促进作用，如利于碱液、酶制剂等的渗透，可以加速革纤维的分离，提高鞣液中铬的吸收率以及起到匀染的作用等[2]。正因为表面活性剂脱脂具有如此多的优点，因此受到制革工业的青睐。但是，在表面活性剂脱脂为我们带来众多方便时，其作为一类化工试剂，在使用过程中会造成COD值增大，带来环境污染[3，4]。

酶是一种蛋白质，同时也是一种具有生物催化活性的物质，它无毒、对环境没有污染，相比于化学催化剂，具有更高的催化效率。在日益注重环保及可持续发展的今天，酶法脱脂受到越来越多的关注和重视。但是，目前酶法脱脂的应用还是受到一定的限制，主要原因是酶的价格较高、脱脂率较低，这也是造成脂肪酶脱脂在制革工业中没有得到广泛应用的主要原因[5-7]。

本文研究生物柴油合成脂肪酶ZG与表面活性剂的相容性，主要是为了选择对该脂肪酶具有明显激活作用的表面活性剂与之进行复配，结合酶法脱脂及表面活性剂脱脂各自的优越性，以及两者的协同效应来达到更加理想的脱脂效果。旨在在提高脱脂效率的同时，大幅度减少表面活性剂的用量，以减轻环境污染。

1 实验部分

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 实验材料

脂肪酶ZG工业级（出厂酶活3万U/mL），胜达科技股份有限公司。吐温20（AR），天津市美琳工贸有限公司；吐温60（AR），成都市科龙化工试剂厂；吐温80（AR），成都市科龙化工试剂厂；十二烷基苯磺酸钠（AR），成都市科龙化工试剂厂；平平加O（LR），成都市科龙化工试剂厂；乳化剂OP-10（AR），成都市科龙化工试剂厂；十二烷基硫酸钠（AR），成都市科龙化工试剂厂。盐干绵羊皮，成都新世纪皮革有限公司；二氯甲烷(AR)，成都市科龙化工试剂厂；化学脱脂剂（工业级），成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2 实验仪器

BS-124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；WH-2微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司；QZX-C空气振荡器，哈尔滨市东明医疗器械厂；81-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器厂；PHS-2C酸度计，上海大中分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 不同表面活性剂对酶活力的影响

表面活性剂质量浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 g/L，用单因素实验，研究不同浓度的表面活性对酶活力的影响，确定出对脂肪酶ZG激活作用较强的表面活性剂种类。

1.2.2 利用响应面优化法优化表面活性剂复配体系

在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken响应面试验设计方法，以OP-10浓度、LAS浓度和平平加O浓度为自变量，以脂肪酶ZG的酶活力为指标进行优化，得到优化后的表面活性剂体系，再与脂肪酶ZG复配。响应面分析试验因素水平见表1。

表1 响应面分析试验因素水平表Tab.1 Response surface analysis test factor level table

1.2.3 脂肪酶ZG与表面活性剂体系复配方案优化研究

将脂肪酶ZG稀释不同倍数（×5、×6、×7、×8、×9、×10），再与由响应面优化得到的表面活性剂体系混合，采用铜皂法测酶活力，确定酶与表面活性剂复配的最优方案。运用Box-Behnken模型设计实验，并对拟合曲面的形状进行分析。

1.2.4 化学脱脂剂与复配酶脱脂效果比较实验

将绵羊皮一分为二，分别用化学脱脂剂和复配酶Es进行脱脂。按照绵羊皮服装革工艺，分别在预浸水、主浸水、脱灰以及软化工序加入0.5%的化学脱脂剂，0.25%复配酶Es进行对比试验。分别在四个工序结束时取样，然后用索氏抽提法测定皮样（沿着背脊线取样）的油脂含量。

2 结果与讨论

2.1 表面活性剂的筛选

2.1.1 LAS、OP-10、平平加O对酶活力影响

由图1可看出，当阴离子表面活性剂LAS与脂肪酶ZG接触时，在低质量浓度（1~3 g/L）范围时，随着LAS浓度的增加，脂肪酶的活力逐渐增大并达到最大值；当质量浓度大于3 g/L后酶活力陡然下降；当酶质量浓度增加到为9 g/L时，酶活力降低了25%左右，说明LAS应用的最佳质量浓度应为3 g/L。这是因为当LAS的浓度较低时，此时n值较小，形成的(R-B)n-E型复合物有利于脂肪酶水解甘油三酸酯。随着LAS浓度的增加，n值增加，表面活性剂与同一酶分子结合的数目相应增多，酶分子与表面活性剂作用增强而破坏酶的活性。

图1 不同质量浓度LAS、OP-10、平平加O对脂肪酶ZG活力的影响Fig.1 The effect of different concentrations of LAS、OP-10、PinpingaO on the activity of lipase ZG

由图1可知，当OP-10质量浓度低于6 g/L时，随着浓度的增加，酶活力缓慢增加；当质量浓度达到6 g/L时，酶活力达到最大值；随着浓度的继续增加，酶活力开始减小；当质量浓度增加到9 g/L时，其活力仅为最大酶活力的2/3左右。推测可能是当酶浓度较低时，OP-10与酶的结合较弱，对酶构象的影响较小，且还能在一定程度上稳定酶的构象，从而使酶活力增加；当OP-10浓度增大时，它与酶的相互作用增强，从而影响酶的构象，降低其稳定性，使酶活力降低。因此OP-10应用的最佳质量浓度为6 g/L。

由图1可看出，当平平加O质量浓度为3 g/L时，对脂肪酶的激活作用最强，此时酶活力达到最大值；随着浓度的继续增加，脂肪酶ZG活力逐渐下降；当质量浓度增加到9 g/L时，酶活力降低到最大酶活力的60%左右。因此平平加O应用的最佳质量浓度为3 g/L。

2.1.2 Tween20、Tween60、Tween80对酶活力影响

从图2可以看出，Tween20在7 g/L质量浓度下对脂肪酶的激活作用达到最大，浓度继续升高，脂肪酶活力陡然下降，当质量浓度增加到9 g/L时，其活力仅为最大酶活力的一半。可见Tween 20应用的最佳质量浓度为7 g/L。

图2 不同质量浓度吐温20、吐温60、吐温80对脂肪酶ZG活力的影响Fig.2 The effect of different concentrations of Tween20、Tween60、Tween80 on the activity of lipase ZG

由图2可知，在一定范围内随着Tween60浓度的增加，脂肪酶ZG活力逐渐增强，且在6 g/L时达到最大值；随着浓度的进一步升高，酶活力开始降低，且浓度越大，降低越明显，酶活力越低。因此Tween60应用的最佳质量浓度为6 g/L。

由图2可以得知，不同浓度Tween80对脂肪酶活性的影响呈一条较平滑的曲线，当Tween80质量浓度为4 g/L时，对酶活力的激活作用达到最大，因此Tween80应用的最佳质量浓度为4 g/L。

2.1.3 对脂肪酶ZG激活作用最好的表面活性剂的选择

由表2可知，表面活性剂对酶的激活作用大小顺序为：LAS(3 g/L)＞平平加O(3 g/L)＞OP-10(6 g/L)＞Tween80(4 g/L)＞Tween20(7 g/L)＞Tween60(6 g/L)。可见LAS、平平加O、OP-10对酶活力的促进作用高于吐温系列。LAS作为一类典型的阴离子表面活性剂，易溶于水，与非离子型表面活性剂的配伍性好，当其质量浓度为3 g/L时，其激活作用略优于其余5种表面活性剂。而OP-10、平平加O为非离子型表面活性剂，当其用量为6、3 g/L时，对酶也具有较强的激活作用。而对于吐温系列，对脂肪酶ZG的激活作用较弱，且用量相对较大。因此充分考虑生产成本及作用效果等因素，选择LAS、OP-10、平平加O这三种表面活性剂及其对应的浓度，通过响应面优化实验找出三者的最佳复配方案，从而最大限度的提高酶活力。

表2 表面活性剂对脂肪酶ZG的最佳激活浓度以及对应的酶活力Tab.2 The optimal activation concentration of surfactant for lipase ZG and the corresponding enzyme activity

图4 平平加O及OP-10用量对脂肪酶ZG活力影响的等值线图及曲面图Fig.4 Contour plot and surface plot of the effect of Pinpinga O and OP-10 dosage on the activity of lipase ZG

图5 平平加O及LAS用量对脂肪酶ZG活力影响的等值线图及曲面图Fig.5 Contour plot and surface plot of the effect of Pinpinga O and LAS dosage on the activity of lipase ZG

2.2 响应面实验结果与分析[7-10]

2.2.1 响应面设计实验结果

Box-Behnken实验设计及响应值(脂肪酶活力)见表3。

表3 N=15的Box-Behnken实验设计与结果Tab.3 Box-Behnken experimental design and results with N=15

实验数据用Minitab 16分析，得出脂肪酶ZG活力与OP-10、LAS、平平加O浓度关系的回归方程：酶活力（U/mL）=21766.4+417A+4896.7B+1033.4C-121.2A2-706.3B2-219.7C2+49.6AB+159.8AC+5.9BC。

2.2.2 响应面分析及表面活性剂浓度确定

混凝土的施工技术与浇筑质量会影响水利水电施工的效率和质量，在浇筑混凝土之前应清洗模板内的油污与杂物，将模板的缝隙与空洞堵严，并用清水湿润木模板，确保混凝土的浇筑质量。施工前应校对模板的尺寸与标高，保证钢筋的安装与绑扎能顺利完成，确保钢筋的配置、数量与保护层的厚度设置正确无误。在浇筑混凝土时应按照从低处向高处浇筑的原则来进行，并按照设计的需要处理每层混凝土的厚度，确保其符合配筋设计与振捣要求[3]。浇筑时对留置施工缝有严格要求，这就需要在浇筑之前设置好施工缝的位置。

通过回归方程绘制分析图，对拟合曲面的形状进行分析考察，结果如图3~5所示。

图3 LAS及OP-10用量对脂肪酶ZG活力影响的等值线图及曲面图Fig.3 Contour plot and surface plot of the effect of LAS and OP-10 dosage on the activity of lipase ZG

利用实验设计软件minitab 16，通过二次回归设计得到了脂肪酶ZG活力与LAS、OP-10、平平加O浓度的回归模型，经检验表明该模型是可靠的，能够较好地预测脂肪酶活力变化。在对影响脂肪酶活力的因素及其相互作用进行探讨后，得到优化的工艺参数为：OP-10质量浓度为6 g/L，LAS质量浓度为3.5 g/L、平平加O质量浓度为4.5 g/L。将上述三种表面活性剂以一定比例混合，制得表面活性剂复配体系后再与酶复配。利用软件得出酶的活力理论值为34 000 U/mL，而实验验证结果为34 454 U/mL，可知理论值与实验值相差较小，说明利用响应面分析方法对脂肪酶影响因素进行优化是可行的，同时在优化的表面活性剂浓度基础上，测得酶活力由原来的28 000 U/mL增加到34 454 U/mL，说明优选出的表明活性剂体系对酶活力有较大的促进作用。因此选用此表面活性剂体系与脂肪酶ZG进行复配。

2.3 脂肪酶ZG与表面活性剂复配方案优化研究

通过响应面优化实验，得到了对脂肪酶ZG激活最强的表面活性剂体系即OP-10质量浓度为6 g/L，LAS质量浓度为3.5 g/L、平平加O质量浓度为4.5 g/L。将脂肪酶ZG稀释一定倍数，再与该表面活性剂体系以一定比例混合，实验结果如图6示。

由图6可以看出，将脂肪酶ZG稀释一定倍数后再与表面活性剂体系混合，随着酶液稀释倍数的增加，酶活力增长率出现先增大再减小的趋势。当酶液稀释倍数较低，即酶浓度较高时，酶分子相对于表面活性剂而言是过量的，从而一部分酶分子未能与表面活性剂作用，表现为酶活力增长率较低；当稀释倍数增加到7倍时，表面活性剂恰好与酶分子充分反应，对酶的激活作用最强，激活率约为27%；随着稀释倍数的进一步增加，即酶浓度进一步的降低，表面活性剂相对于酶分子而言是过量的，从而一部分表面活性剂未能与酶作用，表现为酶活力增长率下降。当酶稀释7倍再与表面活性剂体系复配，效果最好。

图6 酶稀释倍数与酶活增长率关系Fig.6 The relationship between enzyme dilution ratio and enzyme activity growth rate

由此得到脂肪酶ZG与表面活性剂体系复配的较佳配比为脂肪酶ZG稀释7倍后，再与表面活性剂体系复配，得到复配酶制剂命名为：Es（脂肪酶ZG+表面活性剂体系），酶活力较复配前增加了27%，达到35 560 U/mL。

2.4 复配前后对比

复配酶Es由脂肪酶ZG+表面活性剂体系（OP-10质量浓度为6 g/L，LAS质量浓度为3.5 g/L、平平加O质量浓度为4.5 g/L）构成。这三种表面活性剂的批发市场价格（百度网）分别为OP-10：16元/kg，LAS：12元/kg，平平加O：14元/kg。由此计算出复配酶Es的成本价大概为：

由表4可以看出，复配后不仅酶活力有大幅度提升，增加了27%，而且成本也大幅下降了，降低了85.6%。因此直观可以看出复配效果较好。

表4 复配前后对比Tab.4 Comparison of parameters before and after compounding

表5的两种脱脂剂在四个工序的脱脂数据表明，当复配脂肪酶Es的用量为化学脱脂剂一半时，酶的脱脂率均略高于化学脱脂剂。复配酶的最终脱脂率可达到70.26%，比化学脱脂剂高3.78%，比传统酶法50%左右的脱脂率有了较大的增幅，说明将脂肪酶与表面活性剂复配后用于脱脂操作是可行的。

表5 脱脂应用试验结果Tab.5 Results of degreasing applicatin test

见表6所示，用复配脂肪酶Es脱脂，表面活性剂的量相对于化学脱脂剂减少了99.3%，说明脂肪酶ZG与表面活性剂复配后，极大地减少了表面活性剂的用量，同时协同作用使得脂肪酶的活力增强，在用量为化学脱脂剂的一半的情形下，仍然具有较强的脱脂能力。通过复配，酶的应用成本比化学脱脂还低32.67%，因此推广应用前景广阔。

表6 复配酶与化学脱脂剂的成本及用量对比（以下数据均以生产100 kg皮计）Tab.6 Comparison of the cost and dosage of compounding enzyme and chemical degreaser(Based on 100 kg sheep skins)

3 结论

（1）对脂肪酶ZG具有较强激活作用的表面活性剂为：LAS、平平加O、OP-10。采用响应面优化法对上述三种表面活性剂的激活浓度优化结果表明，OP-10为6 g/L、LAS为3.5 g/L、平平加O为4.5 g/L。最优参数下的酶活力预测值为34 000 U/mL，实验测得酶活力为34 454 U/mL，可见预测值与实验值相差较小。

（2）脂肪酶ZG与表面活性剂体系复配方案优化研究表明，脂肪酶ZG稀释7倍后再与表面活性剂体系进行复配效果最好。相对于初始酶活力增长了27%，达到35 560 U/mL；成本下降了85.6%。

（3）脱脂应用实验结果表明，复配脂肪酶Es的用量为化学脱脂剂一半时，复配酶的最终脱脂率可达到70.26%，比化学脱脂剂高3.78%；应用复配脂肪酶Es脱脂，表面活性剂的量相对于化学脱脂剂减少了99.3%，复配酶的应用成本比化学脱脂低32.67%，因此清洁和环保，推广应用前景广阔。